Способ количественного определения формазонов в клетках при гистохимических реакциях

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ НИЯ Союз СоветскихСоциалистическихРеслублик К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(23) Приоритет -Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытийОпубликовано 230133. Бюллетень Мо 3 Дата опубликования описания 23.01.83 53) УДК 619-091. 8(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОРМАЗА В КЛЕТКАХ ПРИ ГИСТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ е 180-18 ни ди по тк длителен,мическихзможностия формап Изобретение относится к гледицине, а именно гистохимии, к способам выявления ферментов в срезах тканей.Известен способ количественного определения формаэанов в клетках при гистохим 1 лческих реакциях путем приготовления криостатных срезов с последующей их инкубацией в. ферментном субстрате остановкой гистохимической реакции и экстракции формазанов (1 1.Однако известный способтребует большого расхода хивеществ, не обеспечивает вополного выявления содержаниванов.Цель изобретения - полное выявление содержания формаэанов,Эта цель достигается тем, что при осуществлении количественного о ределения формазанов в клетках при гистохимических реакциях путем приготовления криостатных срезов с последующей их инкубацией в ферментном субстрате, остановкой гистохимической реакции и экстракции форма.эанов, гистохимическую реакцию останавливают обработкой срезов 0,01 й раствором соляной кислоты, а экстракцию формазанов ведут диметилсульфоксидом при температур 5 оСв течение 5-10 мин.Способ осуществляют следующимобразом.В качестве абстрагирующего оргаческого веществ используют чистыйметилсульфоксид ДМ 50 ), которыйзволяет полностью извлечь из срезоани миокарда, печени и скелетноймышцы формаэана тетразолиевой солинитро-СТ при температуре 180-185 С.Для определения в срезах тканей фор"мазанов: 10 мкм криостатные срезымонтируют по 4 на покровных стеклахразмером 24 24 мм 1 инкубируют 15 минв срезах, содержащих соответствующийсубстрат (сукцинат-, лакта-, иэоцитрат, Ы -глицерофосфат-, глутамат Омалат-глюкозофосфат-, р -бутерати др. ), для выявления ряда дегидрогеназ; срезы промывают дистиллированной водой и погружают на 0,5-1 минв 0,01 МНС; дважды промывают дистиллированной водой и высушивают втечение 3 мин при комнатной температуре; затем срезы для экстракцииформазанов помещают в бюкс с 3 млчистого ДИЕГО; элюирование проводятв сушильном шкафу при температуре185 ОС в течение 5-10 мин, 8-10-минутную991233 Формула изобретения Составитель ЮеАлмаэовРедактор В.Лазаренко Техред Ж,Кастелевич 1(орректор Г Огар Заказ 119/58 Тираж 871 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская набер д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 обработку применяют для высокоактнв. ных ферментов (сукцинатдегидрогеназы СДГ, лактакдегидрогеназы ЛДГ, изоцитратдегидрогеназы ИЦДГ, НАД- и НАДФ-диафораэ )5-7-минутная обработка - для слабоактивных (малатде гидрогенаэы МДГ, альфа-глицерофосфатдегидрогеназы ор,-ГФДГр глутаматдегидрогеназы ГДГ, бета-бутератде.гидрогеназы -БДГр глюкозо-фосфатдегидрогеназы ГФДГ ), Элюат стаби лен в течение одного часа. Измерение оптической плотности элюата (д) производят на спектрофотометре.Оптическая плотность элюата характеризует оптическую плотность формазанов 15 при спектральной характеристике,равной 560 нм, Проекцией срезов или планиметрией замеряют площадь (5 ) срезов. Делением цифровых показателей оптической плотности (13) формазанов щ на площадь (5 ) определяют его оптическую плотность на единицу площа-: ди среза ткани.П р и м е р. Проводят гистохимическую обработку 10 мкм криостатных срезов миокардиальной ткани, мог: тированных на покровных стеклах: 15-минутная их инкубация в соответствующих срезах для выявления активности ЛДГ, о-ГФДГ и СДГ, промывка срезов дистиллированной водой, ферментативная блокада 0,01 Н раствором соляной кислокы (045 в мин ); дву кратная промывка их дистиллированной водой и трехминутное высушивание при комнатной температуре. После гистохимической обработки определяют площадь (5 ) путем их проекции на кальку и последующего взвешивания, но с переводом затем граммов в см.5 срезов для ДМ 50 при определении ЛДГ (на рЯ560 мм ) 5 = 1,025 смур с 4-ГФДГ 5 = 0,477 см 2 и СДГ 5 = 1 150 см, Для экстракции формазанов - продуктов гистохимической реакции срезы одного покровного стекла каждой реакции об рабатывают чистым ДМ 50 в течение 8 10 мин при определении активности ЛДГ, СДГ и 5-7 мин - при определении ср.-ГФДГ. Обработку срезов проводят в 3 см ДМЗО при.= 180 оС г 0 в сушильном шкафу, После экстракции через 0,25 ч проводят измерение опти-. ческой плотности (4,"ф) элюатов - ЛДГ(14 = 0,140 ) и СДГ (П= 0,558 ) на спектрофотометре, Делением цифровых показателей оптической плотности (Й) на площадь среза (5 ) определяют оптическую плотность формазанов на единицу площади среза,ЛДГ 7,= 560 нм =П 0 181015 0,111 с 0-гфдг 1=580 ны: - 0 - д 7 = О, 293; СДГ= 560 нм =0 0 558у 50 = 05485. Полученныер оптические плотности формазанов характеризуют активность каждого определяемого фермента в срезах ткани миокарда.Применение предложенного способа количественного определения формазанов в срезах тканей обеспечивает по сравнению с известным способом возможность полного экстрагирования иэ срезов тканей формазанов вследствие применения высокого температурного режима и элюента - чистого диметилсульфоксида, позволяет сократить время. количественного определения формазанов до 0,5-1 ч против 2,5 - 3,5 ч при известном способе, получить более стабильный элюент. Способ количественного определения. формазанов в клетках при гистохимических реакциях путем приготовления криостатных срезов с последующей их инкубацией в ферментном субстрате, остановкой гистохимической реакции и экстракции формаэанов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью полного выявления,содержания формазанов, гистохимическую реакцию останавливают обработкой срезов 0,01 Н раствором солянои кислоты, а экстракцию формазанов ведут диметилсульфоксидом при температуре 180-185 оС в течение 5-10 мин,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Асп 4 ап Г.Р, 5 гг 1 сег оГ 4 еЬге Уог дег ТЫ еггеЬь. - "Н 1 ьйосЬерп 1 ьсгу",1974, 38, 9 2, р. 155-171,