Способ получения тромболитического фермента

О П 1 Н."-А"М И Союз Советския Социалистических Республик(22) Заявлено 26.05. 78 (21) 2622908/28 с присоединением заявки Нов(5)М. Кл,С 12 3 13/1 рственный комнтеСССРлам изобретенийи открытий го ле(53) УДК 615. 779 .94(088.8) Дата опубликования описания 17. О. К, Г Г. В, А лов, Н. С. Мурашова, М. А. Козлова, енко, А.Б. Силаев, Р.А. Максимова,Ти В. М. Русанов А.Субботина Серебрякова) Авторызобретени ентральный ордена Л аучно-исследователь рови и Московский гим. М. В. нина и орденакий институт гсударственныйомоносова удового Кратологии ииверситет ного Знаме ереливания 1) Заявители 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА в дистиллирою ей ильт аИзобретение относится к медицине,а именно к способам получения биологически активных препаратов.Известен способ получения тромболитического фермента путем выращивания гриба ТгсЬосЬесцп гоьеигп, зкстракции сопутствующего антибиотикатрихоцетина органическим растворителем с последующим осаждением целевого продукта органическим растворителегл и его очисткой 11Однако известный способ не обеспечивает высокой чистоты препарата,а выход его составляет 500 мг сырцаили нативного протеолитического белка - фермента иэ 1 л культуральнойжидкости,Цель изобретения - повышение выхода и чистоты фермента.Укаэанная цель достигается тем,что целевой продукт осаждают 96 -нымзтиловым спиртом при (-4)-(-7)оС ирН 6,8-7,0, отделяют осадок центрифугированием при (-3)-(-2)ОС, затемполученный осадок растворяют в охлажденной апирогенной воде из расчета1,5-1,55 г на 10-10,5 мл воды и проводят очистку при 0-1 С.Кроме того,. целевой продукт очищают последовательно осветляющей фильтрацией, диализом противанной воды и стерилизу щ Ф Р цией.П р и м е р. 100 л культуральной жидкости с активностью 400 мм или 2664 уд.ед/мг после отделения от мицелия помещают в реактор при 20-22 ОС и экстрагируют затем 4 л хлористого метилена посредством непрерывного перемешивания в течение 10 мин и последующего отстаивания в течение 1 ч, Экстракт, содержащий антибиотик, удаляется через нижний спуск реактора. Измеряют объем водного слоя, содержащего фибринолитические Ферменты, Водный слой перекачивают в реактор, который имеет рубашку с рассолом для поддержания рабочей температуры (-4)- 8)о СДалее проводят осаждение Фибринолитичесоких ферментов трехкратным объемом 96 -ного этилового спирта, предварительно охлажденного до -10 оС.Осаждение проводят при (-4)-(-7) С и рН 6,8-7,0. Выпавший через 3 ч осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 2.000-2.500 тыс.об/ /мин на центрифуге с охлаждением до -3 С. Полученную массу фибринолитических Ферментов (1 кг 800 г) растворяютФ787463 Формула изобретения Составитель С. Малютина Редактор М.Дылин. Тех ед Н. Г аб Ко екто В. Б тягаТираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва 3-35 Ра шСкая наб.Заказ 8278/25 4 5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 в апирогенной дистиллированной воде(из.расчета 1,5 г осадка на 7,0 мпводы). Раствор подвергают осветляющей фильтрации посредством пропускания его через бумажное тесто подвакуумом. После окончания фильтрации бумажное тесто промывают дистиллированной вбдой (иэ расчета 3 млводы на 1,5 г осадка) для полного.выхода фибринолитических ферментов иэбумажного теста в раствор, фильтратдиализуют в целлофановых мешках марки 250-7 и против апирогенной дистиллированной воды в течение 48 ч приООС, а затем подвергают стерилиэующей фильтрации через фильтры марки"Миллипор" при величине пор стериллизующей пластины 0,22-0,3 мкм и разливают в пенициллиновые флаконы по2-3 мл. Разлитый фильтрат замораживают и лиофильно высушивают в течение24 ч при максимальной температуре подогрева 20 С.Полученный препарат представляетсобой аморфное вещество белого цвета,хорошо растворимое в дистиллированной воде и физиологическомрастворе,и является комплексом фибринолитических ферментов.Применение хлороформа для экстракции антибиотика (из расчета 4 л хлороформа на 100 л культуральной жидкости) не изменяет схемы способа получения тромболитического препарата.Использование предлагаемого способа выделения фибринолитических ферментов из непатогенных плесневых грибов Тг 1 сЬо".1 ес 1 цщ гоьецщ обеспечивает увеличение выхода препарата-сырца в 3,6 раза, Кроме того, улучшают-.ся тромболитические свойства препарата, которые выражаются в достижении 80 полного лизиса экспериментальных тромбов,В опытах 1 п ч 1 сго установлено,что добавление небольших количествпрепарата к плазме вызывает быстрыйлизис кровяного сгустка, Увеличениеконцентрации препарата препятствуетобразованию сгустков. Оптимальная концентрация, способствующая лизисутромбов, равна 15 мг/мл. При изучении ферментативных свойств обнаружено, что препарат обладает способностью активировать плазминоген, Выделенный протеолитический ферментобладает фибринолитической активностьюв 3 раза большей, по сравнению сфибринолизином.Внутривенное введение препарата животным вызывало у большинства из нихлизис тромбов в течение 1-9 ч, вто время как в контроле лизис тромбов не отмечался в течение опыта(24 ч). Применение препарата в сочетании с гепарином сокращает сроки 15 лиэиса сгустков в 3-4 раза (возрастает тромболитическая эффективностьпрепарата). 2 О 1, Способ получения тромболитического фермента путем выращивания гриба Тг 1 сЬосЬесцщ гоьеца, экстракциисопутствующего антибиотика трихоцетина органическим растворителемс последующим осаждением целевогопродукта органическим растворителемего очисткой, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода и чистоты фермента, целевой продукт осаждают 96 ф-ным этиловым спир том при температуре (-4) в (-7) С иорН 6,8-7,0, отделяют осадок центрифугированием при (-3)-(-2)ОС, затемполученный осадок растворяют в охлажденной апирогенной воде из расчета 35 1,5-1,55 г на 10-10,5 мл воды и проводят очистку при 0-1 С.2. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что целевой продукточищают последовательно осветляющейфильтрацией, диалиэом против дистиллированной воды и стерилизующей фильтрацией. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Авторское свидетельство СССРР 469348, кл. С 12 Э 13/1 д, 1973.