Способ получения рибонуклеаз из

Союз Советскмк Соцмапмстмческмк Республмк(51)М, Кл.з С 12 Э 13/10 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(71) Заявитель Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОНУКЛЕАЗ ИЗ А 5 РЕКСЕЕ 05 С.ЯЧЯТО 5 Изобретение относится к биохимии, а именно к способам одновременного получения вне- и внутриклеточных ферментов миКробиологическим путем.Известен способ получения гуанилспецифичной внеклеточной рибонуклеазы Аьрегд 111 ць с 1 ачасць, предусматривающий культивирование продуцента на комплексной питательной среде, отделение мицелия фильтрованием, осаждейие рибонуклеаэ иэ Фильтрата культуральной жидкости с последующей хроматографией ферментов на ДЭАЭ-целлюлозе и кристаллизацией. Цосле повторной хроматографии на ДЭАЭ 15 целлюлозе проводят гельфильтрацию на сефадексе С, Способ предполагает получение только одного фермента из материала одной ферментации ЕЦ .Недостатками данного способа яв ляются невысокий -выход фермента и получение только одного фермента.Цель изобретения - повышение выхода целевых продуктов, более полное использование сырья и воэможности 25 разделения неспецифичных и гуанилспецифичных рибонуклеаз.Указанная цель достигается тем, что мицелий продуцента лиофильно вы. сушивают, экстрагируют из него бу- ЭО фером при рН 4-9 внутриклеточные рибонуклеазы, а затем по единой схеме осуществляют очистку внутриклеточных и внеклеточных рибонуклеаэ, полученных осаждением иэ фильтрата культуральнои жидкости, после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе проводят разделение неспецифичных и гуанилспецифичных рибонуклеаз на ЙАЕ- .сефадексе, после чего препараты неспецифичных рибонуклеаз подверга 1 рт гельфильтрации на сефадексе 6-75 и хроматографии на О АЕ-сефадексе, а препараты гуанилспецифичных рибонуклеаэ хроматографируют на КМ-целлюлозе и кристаллиэуют.Способ осуществляют по следующей схеме.Гриб Аьрегд 111 цэ с 1 ачасць выращивают на комплексной питательной среде, Мицелий отфильтровывают и лиофильно сушат. Белки из лиофильно вы" сушенного мицелия экстрагируют буферным раствором. Белки фильтрата культуральной жидкости осаждают добавлением сульфата аммония и растворяют в буферном растворе. Белки и экстракта и раствора сорбируют иа ДЭАЭ-целаолозе, элюируют, Элюаты хроматограФируют на колонках с ЦАЕ-сефадексом787464 . Формула изобретения Составитель Л, БеляковаТех ед А. Ач Ко екто Г. Решетиик Редактор Т. Кинь Тираж 522 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035 Москва, ЖРаушская наб. д. 4 5 Заказ 8278 25 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 для разделения неспецифичных и гуанилспецифичных РНКаз. Далее растворы неспецифичных рибонуклеаз подвергают гельфильтрации на колонках с сефадексом С. Элюаты хроматографируют на колонках с С 1 АЕ-сефадексом, Растворы гуанилспецифичных рибонуклеаз подвергают хроматографии на колонках с КМ-целлюлозой, затем проводят кристаллизацию ферментов при диализе.П р и м е р. Гриб Арегд 111 аь с 1 а чайоь выращивают в ферментере на комплексной среде, Мицелий отфильтровывают и лиофильно сушат, Белки из лиофильно высушенного мицелия экстрагируют 0,05 М трио-НСР буфером, рН 7,5 (16 л/кг сухого мицелия)Белки Фильтрата культуральной жидкости осаждают добавлением сульфата аммония (660 г/л) и растворяют в 0,1 М трис-НСк буфере, рН 7,5, Белки из экстракта и раствора белков, осажденных сульфатом аммония, сорбируют в статике на ДЭАЭ-целлюлозе или ДЭАЭ- сефадексе (5 г сухого сорбента/1 л) уравновешенных 0,1 М трис-НС 1 буфером, рН 7,5. Элюцию проводят 2 л 0,5 М ацетатного буфера, рН 4,5, Элюат подвергают хроматографии на колонке с 0 АЕ-сефадексом (5 х 50 см), элюцию проводят линейным градиентом ионной силы исходного буфера (0,05-0,5 М),Далее очистку неспецифичных и гуанилспецифичных рибоиуклеаз проводят раздельно. Растворы неспецифичных рибонуклеаз подвергают гельфильтрации на колонке с сефадексом 6-75 (5 х 100 см), уравновешенной 0,05 М трис-НС 1 буфером, рН 7,05, содержащим 0,1 М КСГ. Затем проводят хроматографию на колонке с (АЕ-сефадексом (5 х 50 см), фермент элюируют линейным градиентом ионной силы исходного буфера (0,05%0,5 М). Растворы гуанилспецифичных рибонуклеаз подвергают хроматографии на колонке с КМ-целлюлозой (5 х 20 см), уравновешенной 0,05 М ацетатным буфером, рН 4,5. Фермент элюируют линейным градиентом 0-0,5 М йаС 1 в исходном буфере. Затем проводят кристаллизацию ферментов при диализе против разбавленных буферов, рн 3,5, 5,0, 5,6.Описанный способ позволяет получить в результате одного процесса культивирования по единой схеме очистки четыре фермента: неспецифичные и гуанилспецифичные вне- и внутриклеточные рибонуклеазы. Способ получения рибонуклеаэ изАьрег 9111 ць с 1 ачаоь, предусматривающий культивирование продуцента на15 комплексной питательной среде, отделение культуральной жидкости отмицелия фильтрованием, осаждение рибонуклеаз из фильтрата культуральнойжидкости с последующей хроматографи 20 ей ферментов на ДЭАЭ-целлюлозе и кристаллизацией, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, более полного использования сырья и возможностиразделения неспецифических и гуанилспецифических рибонуклеаз, мицелийпродуцента лиофильно высушивают, экстрагируют из него буфером при рН 4-9внутриклеточные рибонуклеазы, а затемпо единой схеме осуществляют очисткувнутриклеточных ферментов и внеклеточных рибонуклеаэ, полученных осаждением.из фильтрата культуральнойжидкости, после хроматографии наДЭАЭ-целлюлозе проводят разделениенеспецифических и гуанилспецифических рибонуклеаз на 0 АЕ-сефадексе,после чего препараты неспецифических рибонуклеаз подвергают гельфильтрации на сефадексе Си хроматогра 4 О Фии на 0 АЕ-сефадексе, а препаратыгуанилспецифичных рибонуклеаз хроматографируют на КМ-целлюлозе и кристаллизуют.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССРР 596616, кл. С 12 Р 13/00, 1978.