Способ получения диоксиацетона

41 вм;чо тел;.-рнаяЬяввна Ю й. АО П Союз Советскии Социалистическими Республик(61) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 23.02.79 (21) 2728952/28-13с присоединением заявки Ио -(осударствеииый комитет СССР по делам изобретеиий и открытиИ(72) Авторы изобретения Т. А, Махоткина, Н. В, Поморцева, И, Е, Ломова,П. И. Николаев, Н. А. Кустова П.П. Макеев,Т. Н. Миронова и В, Н, Максименко Московский ордена Трудового Красного Знамени институт химического машиностроения(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИОКСИА 1 ЕТОНА Изобретение относится к микробиологическои промышленности, а именно к способу получения диоксиацетона при помощи иммобилизованных в полиакриламидном геле неразмножающихся кле ток СвсопоЬассег охус 1 апь,Использование иммобилизованных ферментов и клеток является перспективным, так как дает возможность применять их в непрерывных автома тизированных процессах, а также в ряде случае позволяет упростить процесс выделения продуктов микробиологического синтеза.Диоксиацетон (ДОА) в Советском 15 Союзе не производится, однако известны широкие возможности его применения в лабораторных биохимических исследованиях, в парфюмерной, легкой и пищевой проььпапенности, а также в ,Я медицине.Известен способ получения диоксиацетона, заключающийся в том, что диоксиацетон накапливается в процессе роста и размножения клеток 61 осо поЬасег охус(апь в богатой органическими добавками среде, содержащей глицерин, кукурузный экстракт, дрожжевую воду, монокалийфосфат и карбонат кальция в условиях аэрации. Процолжительность окисления глицерина растущими клетками бактерий составляет 30 ч. По окончании процесса бактериальную массу отделяют центрифугированием или сепарированием, а целевой продукт получают из культуральной жидкости (11Недостаток этого способа заключается в однократном использовании биомассы бактерий. Кроме того, выделение диоксиацетона затруднено из-за наличия в культуральной жидкости большого количества органических примесей, что является следствием использования для процесса сложной по составу среды, Выделение диоксиацетона в таком случае процесс трудоемкий, включающий обработку культуральной жидкости адсорбентами, что приводит к большим потерям продукта.Наиболее близким к предлагаемому является способ получения диоксиацетона путем выращивания продуцирующих бактерий Сцсопооассег охудапа в условиях аэрации на питательной среде, содержащей глицерин, монокалийфосфат, дрожжевую и водопроводную воду с последующим отделением бактерий от питательной среды, окис. лением глицерина в диоксиацетон не 787462где Я А - количество образовавшегося35 Д" ДО, ",С - количество абсолютно сухой биомассы (СБ), г,"й 1; - продолжительность окисления, ч.П р и м е р 1. Окисление глицеринав диоксиацетон иммобилиэованными в полиакриламидном геле клетками 01 исопоЬассег охудапь в термосватированйыхколонках с аэрацией и без аэрации.Через термостатированную колонку сгранулами геля пропускают среду, состоящую из водопроводной воды, 6 глицерина и 0,2 монокалийфосфата, Средудодают в колонку сверху из градуиро,ванной воронки со скоростью 9 мп/ч,рН,среды 5,0. Вытекающую из колонкижидкость анализируют на содержаниедиоксиацетона, В таких условиях клетки сохраняют жизнеспособность и окислительную способность до 10 сут.55 В табл. 1 приведена окислительнаяактивность иммобилизованных в полиакриламидном геле клеток 61 цсопоЬассегохудапв в термостатированных колонках,размножающимися клетками бактерий иего выделением. Способ заключаетсяв том, что на. первой стадии процесса осуществляют выращивание бактерий при 28 С на среде, содержащейглицерин, монокалийфосфат и отвар пекарских дрожжей, затем клетки бактерий отделяют центрифугированием отжидкой фазы и помещают в 5-8-ныйводный раствор глицерина, содержащий0,2 монокалийфосфата. Нераэмножающиеся клетки бактерий в условиях аэрации интенсивно окисляют глицеринв диоксиацетон. Одну и ту же биомассуиспользуют несколько раз, отделяяклетки бактерий центрифугированием,каждый раз по окончании процесса окисления глицерина (21Недостатком этого способа является то, что каждый раз по окончаниицикла микробиологической трансформации глицерина в диоксиацетон требуется отделение клеток от среды. Такое отделение " процесс длительныйи трудоемкий, требующий использования дорогого оборудования и определенных энергозатрат на сепарацию, атакже может способствовать появлениюинфекции и приводит к потере биомассыЦель изобретения - обеспечениенепрерывности способа получения диоксиацетона, уменьшение потерь биомассы, а также сокращение энергозатрат на процесс получения диоксиацетона, т.е. упрощение способа,Поставленная цель достигается тем,что окисление глицерина осуществляютпредварительно иммобилизованными вполиакриламидном геле клетками бактерий.Способ осуществляют следующим образом.Культуру бактерий 61 цсопоЬасТегохус 1 апэ выращивают в колбах Эрленмейера объемом 750 мл со 100 млсреды, содержащей 6 глицерина, 0,2монокалийфосфата,10 об. 10-нойдрожжевой воды и водопроводную воду.Выращивание ведут на круговой качалке при 28 С в течение 36 ч. Полученную биомассу отделяют центрифугированием, клетки отмывают водой до исчезновения следов, редуцирующих веществ и используют для иммобилизации,Далее клетки 61 цсопоЬасег охудапэиммобилизуют в полиакриламидный поперечносшитый гель, выбранный дляработы потому, что он имеет ряд пре"имуществ перед другими гелеобразующими носителями: нетоксичен для живыхклеток, легко полимеризуется из растфворимых в воде соединений и хорошогранулируется,Включение бактериальных клетокв полиакриламидный гель проводят следующим способом,Для получения геля используют водный раствор 9,5 г акриламида и 0,5 гпоперечносшивающего агента й,й -метиленбисакриламида, в котором суспендируют бактериальные клеткиРеакцияполимеризации идет в присутствии катализаторов - 0,1 г персульфата аммония и О, 1 г й,й,й,й. -тетраметилендиюамина при охлаждении до 12-15 оС ватмосфере азота. Время реакции 1015 мин.Полученный блок геля с включенными в него клетками взвешивают,измельчают и продавливают через сито15 с отверстиями 0,25 мм. Количествоиммобилизованных бактериальных клеток (в пересчете на сухой вес) составляет 5-7 от веса геля-носителя.Полученный по предложенному мето 2 О ду гель с включенными в него клетками используется для окисления глицерина в диоксиацетон.Концентрация накопленного диоксиацетона определяется колориметрическим методом с использованием хлористого трифенилтетразолия.Окислительную активность (А) свободных и включенных в гель клетоквычисляют по формуле787462 Т а б л и и а. 1 0,032 0,048 9,0 0,060 Колонка, наполненнаягрануламис аэрациеймикрокомпрессором 0,204 0,317 0,058 9,0 Данные табл, 1 показывают, что аэрация позволяет значительно увеличить окислительную активность иммобилизованных клеток бактерий 01 цсопоЬасСег охудапь.П р и и е р 2. Окисление глицерина в диоксиацетон иммобилизованными клетТаблица 2. 0,49 0 200 1 200 2 200 0,49 0,72 1,14 2,94 0,49 Свободные 2,32 2,12 3 200 0,49 1,26 1,71 4 200 1,47 0,49 1,50 200 0,52 200 0,52 0,34 1,31 Иммобилиэованные 0,69 1,38 1,28 0,99 1,27 1,27 1,22 Колонка, на.полненнаягрануламигеля, безаэрации 200 0,52 200 0,52 200 0,52 ками СцсопоЬассег охудапь в термостатированных сосудах с аэрацией,В табл. 2 приведены данные по накоплению диоксиацетона свободными иммобилизованными клетками 61 цсопо" Ьассег охудапь в сосудах с аэрацией среды.787462 Таблица 3 Условия опыта Аэрация воздухом 2,10 2,71 0,116 10 Аэрация воздухом обогащенным кислоро- дом. Свободные клетки 5,95 4,76 0,120 10 1,60 1,20 0,113 10 Аэрация воздухом, обогащенным кис- лородом 2,81 2,16 0,115 10 Как видно из табл. 2 за 4 ч свободные клетки накопляют 1,47 диоксиацетона, а иммобилизованные -1,27. Срецняя окислительная активность иммобилизованных клеток в этих условиях составляет 60 от окислительной способности свободных клеток.Данные табл, 1 и 2 показывают возрастание окислительной активности как иммобилизованных, так и свободных клеток при провецении опытов в термостатированных сосудах по сравнению с окислительной активностью данной культуры бактерий в колонках. Так, окислительная активность иммобилизованных клеток за 4-й час опыта в сосудах с аэрацией среды составсДОАляет 111 - , а в колонках максиС 5мальная окислительная активность иммобилизованных клеток составляет ОЫ 7 -гАОЛ,1 СбОднако и в термостатированных сосудах с аэрацией скОрость абсорбции кислорода по-прежнему лимитирует процесс трансформации глицерина в диокси ацетон.П р и м е р 3.Окисление глицерина в диоксиацетон иммобилизованными клет Иммобилизо- Аэрация возванные клет- духомки Как видно иэ табл, 3, свободные и иммобилизованные в геле клетки реа" гируют на интенсификацию аэрации введением в опытные колбы обогащенного кислородом воздуха повышением окислительной активности, а именно свободные клетки при этом повышают окис ками 61 цсопоЬасСег охуОапь в колбахна качалке с азрацией обогащеннымкислородом воздухом. Гранулы гнея свключенными в них клетками помещаютв колбы объемом 750 мл, Колбы встряхивали на качалке при 26 С. Интенсивность аэрации, выраженная сульфитнымчислом, в этих условиях составляет1,5 г Ох/л ч при рабочем объеме вколбе 150 мл. Для окисления глицерина 0 используют раствор, содержащий 60 гглицерина и 2 г монокалийфосфатана 1 л водопроводной воды. Колбы снабжены насадками, через которые с помощью масляного насоса откачивают воздухдо остаточного давления 40 мм рт .ст, 1 и заменяют кислородом. Заполнениеколб проводят каждый час. Для контроля ведут опыты по окислению глицерина иммобилизованными и свободнымиклетками 61 цсопоЬасег охудапь в кол бах, закрытых ватными пробками,т.е, с аэрацией атмосферным воздухом. В табл. 3 приведены данные по влиянияю аэрации на окислительную активность свободных и иммобилизованных клеток СцсопоЬассег охудапь.,лительную активность с 2,71 до Ю 5,Ы . , т.е. в 2,2, раза, а имгДОАгСЬмобилизованные клетки повышаЮт окислительную активность с 1,60 доЯ.,81 -- , т.ев 1,8 раэ. ПриАСЬ6 этом в условиях аэрации воздухом окис.787462 Формула изобретения Составитель М. ЛаринаРе акто Т. Веселова Тех е А. Ач Ко екто Г. Решетник Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва ЖРаушская наб. д.Заказ 8278 25 Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 лительная активность иммобилизованных клеток составляет 59 таковой свободных клеток, а в условиях аэрации воздухом, обогащенным кислородом окислительная активность иммобилиэованных клеток составляет 47 от окис" лительной активности свободных клеток.Следовательно, все три варианта опытов показывают принципиальную воэможность микробиологической трансформации глицерина в диоксиацетон иммобилизованными в полиакриламидном геле клетками 61 цсопоЬасйег охудапь как в непрерывном, так и в периодическом процессе.Предлагаемый способ дает воэможность получать диоксиацетон в непрерывном процессе.Переход от периодического процесса производства к непрерывному с использованием иммобилизованных клеток бактерий позволяет в большей степени автоматизировать процесс, сократить затраты на заработную плату за счет высвобождения части промышленно-производственного персонала и устранения некоторых ручных вспомогательных операций.Совершенствование технологической схемы, увеличение длительности использования биомассы и замена сепарирования культуральной жидкости отстаиванием при использовании включенных в гель бактерий позволяет сократить время производственного цикла и уменьшить сумму капитальных затрат на производственное оборудование.В результате внедрения предлагаемого способа ожидаемый экономический эффект при производстве диоксиацетона мощностью 30 т в год составляет 73,70 тыс. руб. в год. 10Способ получения диоксиацетона путем выращивания продуцирующих егобактерий 61 осопоЬассег охудапь в условиях аэрации на питательной средесодержащей глицерин, монокалийфосфат,дрожжевую воду и водопроводную водус последующим отделением бактерий отпитательной среды, окислением глицерина в диоксиацетон неразмножающимисяклетками бактерий и его выделением, 29 о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью обеспечения непрерывностипроцесса, уменьшения потерь биомассыи упрощения способа, окисление глицерина осуществляют предварительно иммо билизованными в полиакриламидном гелеклетками бактерии. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 30 1. Патент США Р 2948658,кл. 195.-36, опублик. 1960.2. Авторское свидетельство СССРР 427050, кл. С 12 Р 1/00, 1972.