Способ получения -галактозидазы

ОПИСАНИ Е 1 и,718447ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Социалистических Республик(43) Опубликовано 28.02.80, Бюллетень8 (45) Дата опубликования описания 28,02.80 елам изобретений и открытий(71) Заявител ОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Р-ГАЛА И АЗ(5 Изобретение относится к способу получения р-галактозидазы (р-Р-галактозид -галактогидролаза, К. Ф, 3. 2. 1. 23), фермента, катализирующего гидролиз дисахаридалактозы до моносахаридов - глюкозы и галактозы. Фермент является весьма перспективным для практического применения вхлебопечении, при приготовлении концентратов молока, диетических безлактозныхпродуктов, в медицине - для целей заместительной терапии при лечении лактазнойнедостаточности, в сельском хозяйстве -для получения противоящурного иммунолактона.Известны способы получения Р-галактозидазы из микробиологического сырья, например из культуральной жидкости грибаСпгп 1 аг 1 а 1 паедца 11 з, Р-галактозидазу выделяют осаждением органическими растворителями. Получают препарат с удельной 20активностью 0,8 ед/мг препарата илиЗед/мг белка Ц,Наиболее близок по технической сущности к изобретению способ получения 1 з-галактозидазы из клеток дрожжей Яассттагогпусез 1 гар 11 з, заключающийся в экстракции фермента буферным раствором рН 6,9и осаждении (2,Из клеток дрожжей ЯассЬаготпусез 1 гар 11 з фермент экстрагируют 0,001 н. фосфат 2ным буфером рН 6,9. Экстракцию обычно проводят при 5 С в течение 20 ч или при 30 С в течение 4 - 6 ч. Осаждение р-галактозидазы обычно осуществляют органическими растворителями - этиловым спиртом (4 объема) или ацетоном (1,4 объема) при температуре - 6 С. Выход ферментного препарата - 28 - 30%, удельная активность 0,7 ед/мг белка (после осаждения этиловым спиртом) и 1,2 ед/мг белка (после осаждения ацетоном).Недостатками известного способа являются незначительный выход и низкая удельная активность выделенного препарата вследствие значительных потерь активности,Цель изобретения - увеличение выхода и удельной активности р-галактозидазы.Указанная цель достигается тем, что экстракцию и осаждение фермента проводят в присутствии 8-меркаптохинолина с концентрацией (2,5 - 5) 10 - 4 моль/л,8-Меркаптохинолин представляет собой тиолсодержащее соединение, обладающее также хелатными свойствами, формулы718447 Фор мула изобретения Составитель О, Скородумова Техред А, Камышникова Корректор Т. Трушкина Редактор А, Соловьева Заказ 132/16 Изд.186 Тираж 497 Подписное НПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Типография, пр, Сапунова, 2 Мехай 11 зм активаци 11 и стабилизации структуры Р-галактозидазы 8-меркаптохинолином закл 1 очается в защите сульфгид.рильных цистеиновых групп активного центра фермента ог окисления благодаря наличию 5 Н-группы в молекуле 8-меркаптохинолина.Хелатные свойства 8-меркаптохинолина одновременно обеспечивают предотвращение инактивации фермента ионами тяжелых металлов, которые связываются 8-меркаптохинолином с образованием комплексной соли.Согласно изобретению описывается способ получения р-галактозидазы из клеток дрожжей Басс 11 агогпусез 1 гар 111 з путем экстракции фермента буферным раствором рН 6,9 и осаждения, которые осуществляют в присутствии 8-меркаптохинолина при концентрации (2,5 - 5) 10 - 4 моль/л.Описываемый способ обеспечивает выход галактозидазы 74 - 88% и с удельной активностью 7,4 - 11,3 ед/мг белка.Пример 1. 100 г дрожжей ЬассЬ. 1 га 1 т 1- 11 з суспендируют в 1 л 0,001 н. фосфатного буфера рН 6,9 с добавлением 8-меркаптохинолина 2,5 10 - 4 моль/л. Экстракцию проводят в течение 6 ч при 30 С, Затем суспензию центр и фуги руют, Р-галактозидазу из осветленного экстракта осаждают сульфатом аммония (40 - 60% насыщения) . Осадок суспендируют в 50 мл того же буфера и добавляют глицерин (50%), Препарат хранят в виде суспензии в глицерине, Активность 7,4 ед/мг белка. Выход 74%.П р и м е р 2, Экстракт приготавливают по примеру 1. Концентрация 8-меркаптохинолина в буфере - 3,0 10 - 4 моль/л, р-Галактозидазу из осветленного экстракта осаждают 4 объемами этилового спирта при - 6 С. Осадок суспендируют в 100 мл того же буфера, содержащего 8-меркапъохинолин с концентрацией 3 10 - 4 моль/л. Хранят в 50%-ном растворе глицерина. Активность 8,1 ед/мг белка. Выход 84%. Пр им ер 3. Приготовление экстракта иосаждение ведут аналогично примеру 2, концентрация 8-меркаптохинолина 5 10-4 моль/л. Активность 9,3 ед,/мг белка. Выход 87%.П р и м е р 4. Приготовление экстракта иосаждение осуществляют аналогично примеру 2, концентрация 8-меркаптохинолина - 2,5 10 - " моль/л. Активность 8,2 ед/мг 1 о белка. Выход 79%.Пример 5. 100 г дрожжей Яасс 11. 1 гар 11 з экстрагируют в присутствии 1 л фосфатного буфера рН 6,9 с добавлением 2,510 - 4 моль/л меркаптохинолина в течение 15 20 ч при 5 С. Экстракт центрифугируют, недостаточную жидкость концентрируют на ультрафильтрационной ячейке через ацетатцеллюлозные мембраны УАМв 10 раз (давление - 3 атм, температура - ;о 4 - 5 С) 100 мл концентрата промывают3 раза по 1 объему того же буфера с меркаптохинолином (2,5 10 - /л). Активность 11,3 ед/мг белка. Выход 75%, Хранят в 50%-ном глицерине.25 Способ получения Р-галактозидазы изклеток дрожжей Ьасспагогпусез 1 гар 11 з,31 включающий экстракцию фермента буферным раствором рН 6,9 и осаждение, отл ич а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличениявыхода и удельной активности целевогопродукта, экстракцию и осаждение прово 35 дят в присутствии 8-меркаптохинолина приконцентрации (2,5 - 5) 10 - 4 моль/л.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССР480759, кл. С 12 Р 13/10, 1972.2. Фениксова Р, В. и др. Получение препаратов Р-галактозидазы из дрожжейБассЬаг, 1 гар 11 з. - Прикладная биохимияи микробиология, т. 7, вып, 1, 1971, с. 34,45 (прототип),