Способ количественного определения дезоксирибонуклеиновой кислоты в почве

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1 и) УОО 831 Со 1 оз Советских Социалистических Республик(51) М. Кл.зб 01 Я 31/О заявки е присоединением Государственный ком ите 23) Приори, Асеева, Н. Т, Чурси иков 71) Заявител сковский ордена Лени государственный у а и ордена Трудового Красного Знамениверситет им. М. В. Ломоносова ос- су 5 10длитель Количество оснований ДНК,(ммоль/00 г почвы)Относительная шибка метода Метод рототип 0,01,3 длагаемый 30 54) СПОСОБ КОЛИЧЕС ЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИ Изобретение относится к способам определения нуклеиновых кислот в почве и может быть применено в почвоведении, микробиологии, биохимии.Известен способ количественного определения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в почве путем экстракции щелочью (0,3 н. 1 ЧаОН при 20 С), осаждения концентрированной соляной кислотой фракции гуминовых кислот, содержащей ДНК, с последующим гидролизом 72% -ной хлорной кислотой и выделением пуриновых и пиримидиновых основании с помощью ионообменной и бумажной хроматографии с последующим определением пуриновых и пиримидиновых оснований по их поглощению в ультрафиолетовой части спектра.Недостатком способа являетсяность и его невысокая точность.Цель изобретения - сокращение времени анализа и повышение его точности.Достигается это описываемым способом, который заключается в том, что дезоксирибонуклеиновую кислоту экстрагируют из навески почвы 0,65 - 0,75 н. гидроокисью натрия при 60 - 70 С, осаждают соляной кислотой с последующим кислотным гидролизом 0,1 н. соляной кислотой при 37 - 40 С в течение 24 - 30 ч, выделением аденина и гуанина.бумажной хроматографией и опреТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОВОЙ КИСЛОТЫ В ПОЧВЕ делением по их количеству содержания дезоксирибонуклеиновой кислоты.Отличительная особенность способа с тоит в том, что щелочную экстракцию о ществляют 0,65 - 0,75 н. гидроокисью натрия при 60 - 70 С, кислотный гпдролпз ведут 0,1 н. соляной кислотой прп 37 - 40 С в течение 24 - 30 ч, выделяют аденпн и гуанпн бумажной хроматографией н по их количеству судят о содержании дезокеирибонуклеиповой кислоты.Результаты приведены в таблице. Как видно из таблицы, количество ДНК, определяемое предлагаемым способом, равно, например в дерново-подзолистой почве 30,0 ммоль оснований/100 г почвы, что выше в 5 раз по сравнению с прототипом вследствие повышения точности и надежности метода. Относительная ошибка определения уменьшается вдвое при более высокой воспроизводимости результатов.700831 3Г 1 ример 1. Берут 2,5 г воздушно-сухойпочвы, освобожденной от растительных корней и просеянной через сито с отверстиями1 мм, и экстрагируют ее 20 мл 0,7 н. МаОНпри 65 С в течение 25 ч, Щелочной экстракт 5(15 мл), охлажденный до 0 - 5 С, нейтрализуют концентрированной НС 1 и подкисляютдо рН 1,1, Выпавший осадок отделяют центрифугированием, промывают охлажденной0,1 н. НС 1 и оставляют на 24 ч при 37 С с 1020 мл 0,1 н. НС 1. Жидкость объемом 15 млупаривают на водяной бане, сухой материалрастворяют в нескольких каплях 0,1 н. НС 1и количественно переносят на хроматографическую бумагу в виде полосы. Разделение оснований проводят в системе растворителей метанол: концентрированная НС 1:: вода (70: 20: 10) в течение 25 - 27 ч (нисходящая хроматография) . Обнаруженныепри просмотре в ультрафиолете пятна оснований элюируют 5 мл 0,1 н. НС 1 (37 С,12 ч) и спектрофотометрируют против элюента в прямоугольных кварцевых кюветах(ширина 1 см) при следующих длинахволн: аденин- при 228, 260 и 290 нм, гуанин- при 224, 250 и 290 нм, Расчет количества оснований производят по следующимформуламА - "ф (22 ") О 99.0 - величина оптической плотности придлине волны Х; 0,399 и 0,714 - коэффициенты для пересчета величин оптическойплотности в размерности концентрации;1,82 и 2,00 - константы, характеризующие 40спектр поглощения аденина и гуанина соответственно.Содержание ДНК в почве рассчитываютпо формуле(А+ Г) п 21003а Формула изобретения Способ количественного определения дезоксирибонуклеиновой кислоты в почве путем экстракции ее нз навсски почвы щелочью, осаждения соляной кислотой с последующим кислотным гидролизом и выделением образовавшихся азотистых оснований бумажной хроматографией, о т л и ч аю щ и Й с я тем, что, с целью сокращения времени анализа и повышения точности способа, щелочную экстракцию осуществляют 0,65 - 0,75 н. гидроокисью натрия при 60 - 70 С, кислотный гидролиз ведут 0,1 н, соляной кислотой прн 37 - 40 С в течение 24 - 30 ч, выделяют аденин и гуанин путем хроматографии на бумаге и по их количеству судят о содержании дезоксирибонуклеиновой кислоты. Составитель С. ХованскаяТсхред А, Камышникова Корректоры; Е. Осипова и Л. ОрловаРедактор А. Соловьева Заказ 2519/17 Изд. М 626 Тираж 1090 ПодписноеНПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раугпская наб д. 4/5 Типография, пр. Сапунова, 2 где С - содержание ДНК в почве в ммоль оснований/100 г почвы; п - разведения, произведенные в ходеанализа;а - навеска почвы, г;А и Г - количества аденина и гуанина вммоль/5 мл элюата.В итоге получают содержание ДНК в дерново-подзолистой почве, равное 30,0 ммоль оснований/100 г почвы.П р и м е р 2, Берут 2,5 г почвы и экстрагируют ее 20 мл 0,65 н ХаОН при 60 С в течение 25 ч. Остальные операции и расчеты производят по примеру 1. Получают выход ДНК для дерново-подзолистой почвы, равный 29,6 ммоль оснований/100 г почвы.Г 1 р и м е р 3. Экстракцию ДНК из почвы с последующим ее осаждением кислотой проводят по примеру 1, затем осадок гуминовых кислот, содержащий ДНК, дваукды промывают охлажденной 0,1 н. НС 1 и оставляют на 30 ч при 40 С с 20 мл 0,1 н. НС 1, Далее анализ осуществляют по примеру 1 и получают содержание ДНК в дерново- подзолистой почве, равное 30,9 ммоль оснований/100 г почвы.Использование предлагаемого способа имеет следующие преимущества по сравнению с известными: ускорение процесса и повышение его точности.