Способ получения пуриновых дезоксинуклеозид-5 трифосфатов

Союз Советскнх Соцнвлнстнческнх Республнк(51)М, К . С 07 Н 19/16 //С 61 К 31/00 с присоединением заявки Мо Государственный комитет СССР яо делам изобретений и открытий(53) УДК 547,963. . 32 (088.8) Опубликовано 0505,79. Бюллетень И 9 17 Дата опубликования описания 0505,79(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПУРИНОВЫХ ДЕЗОКСИНУКЛЕОЗИД- ТРИФОСФАТОВ Изобретение относится к усовершенствованному способу получения пуриновых дезоксинуклеозид-трифосфатов, которые используются в биохимических исследованиях, например, для получения синтетических аналогов дезоксинуклеиновых кислот. Известен способ получения дезоксинуклеозид-трифосфатов, заключающ)яйся в фосфорилировании соот ветствующих дезоксинуклеозид-монофосфатов в присутствии ионов М(з ацетилфосфата, аденозиндифосфата, цистина, очищенного ферментного пре парата (очищеннои ацетокиназы), вы- ДЕЛЕННОГО ИЗ ЕЗСЬЕГ 1 СЬ 1 а СОР 1 ( Е.СОс 1) и буфера трис- НСс при рН 7,5. Выход дезоксинуклеозид-трифосфатов 60-75 в расчете на исходный 20 дезоксинуклеозид-монофосфат 1). Недостатками такого способа являются использование высокоочиценйого ферментного препарата (очистка которого требует многократного фракционирования выделенного из клеток Е соБ фермента), что осложняет процесс, и относительно невысокий выход целевого продукта (60-75) . 30 Целью изобретения является упрощение процесса и повышение выхода целевого продукта.Цель достигается использованием в .качестве ферментного препарата цельного нефракционированного экстракта из Е.соЕ 1 МКЕ = 600.Это позволяет избежать трудоемких стадии Фракционирования фермента и повысить выход целевого продукта до 80-82.Способ получения пуриновых дезоксинуклеозидф-трифосфатов согласно изобретению заключается в том, что соответствующие дезоксинуклеозид-монофосфаты фосфорилируют в присутствии ионов М)-", ацетилфосфата, в трис-НСе буФете при рН 7,5, используя цельный нефракционированный экстракт Е.сот,т МнЕ = 600, Выход целевого продукта 80-82,П р и м е р . Приготовление Ферментного препарата.50 г клеток Е.соС 1 Мйе.,= 600 суспендируют в 150 мл 0,05 61 трис-НСс буфера (рН 7,5) и разрушают ультразвуком на ультразвуковом генераторе с частотои 18+0,4 кгц в течение 15 мин. Суспензию центрифугируют в течение 20 мин при 12000 с 1,660976 Формула изобретения Составитель Л. НикулинаР акто 3. Бо о кина Тех е И.Петко . Ко екто И. Иуска Заказ 2372/20 Тираж 512ЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035 Москва ЖРа шскаянаб, д. 4/5 Подписное Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 надосадочную жидкость собирают ииспользуют в качестве ферментного препарата. Концентрация белка в нем14 мг/мл. Ферментный препарат хранят в замороженном виде при - 10 ОС.Синтез дезоксиаденозин-трифосфата.1500 мл реакционной смеси состава, мкмоль/мл: дезоксиаденозин-монофосфат 10; ацетилфосфат 30, трисНС 6 буфер (рН 7,5) 40; ацетат магния15; ферментный препарат 0,25 мг/млтермостатируют при 37 С в течение2 ч. Реакцию останавливают прогреванием реакционной смеси в кипящей )5водянои бане в течение 2-3 мин, .азатем быстро охлаждают. Образовавшийся осадок белка удаляют центриФугированием и надосадочную жидкость хроматографируют на ионообменнон смоле Дауэкс 1 х 2 в градиентеЙ С 1 при рН 2,3. Фракции элюата,содержащие дезоксиаденозин-трифосфат, объединяют и нейтрализуютгидратом окиси лития до рН 7,0. Дезоксиаценозин-трифосфат осаждают в виде литиевой соли охлажденнойсмесью этанол-ацетон (10:1) . Осадоксобирают центрифугированием и лиофильно высушивают. Выход дезоксиаденозин-трифосфата 82 в расчете наисходный дезоксиаденозин-монофосфат.Содержание основного веществав продукте 94, спектральные отношения, рН 2: 05 о/Ваьо = 0,82,35О о /Р р 6 = О, 22 . П р и м е р 2. Синтез дезоксигуанозин-трифосфата проводят в условиях примера 1. Готовый продукт выделяют, как в примере 1. выход дезоксигуанозин-трифосфата 80 в расчете на исходный дезоксигуанозин- -монофосфат. Содержание основного вещества в продукте 99. Спектральные отношения, рН 2: Эо /( во =1 0 4Эйзо /П = 0,69Предлагаемый способ получения пуриновых дезоксинуклеозид-трифосФатов прост в технологическом исполнении и может быть применен в промышленном масштабе. Способ получения пуриновых дезоксинуклеозид-трифосфатов путем фосФорилирования соответствующих дезоксинуклеозид-монофосфатов в присутствии ионов Му 4; ацетилфосфата, Ферментного препарата, выделенного из Езс 11 ег 1 с ц 1 О сой, и буфера трисНС 1 при рН 7,5, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, в качестве ферментного препарата используют цельный нефракционированныи экстракт из Езсйег(сп 1 О со 6 МЙЕ = 600.Источники инФормации, принятые во внимание при экспертизе1.ЬеЬпоп Э.В.,Веззтоп М Э;51 мз Е.5., Когпоегр А "Еп 1 зпс 11 с 5 зМЬез 1 з о 1 Эеои Э х 1 ЬопцсСес Ас 13 - Л В 4 оЮ.Спев, 233, Р 1, р. 163 (1958).