Способ получения ферментного препарата нигедазы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 19) ( 1) 5 С 12 й 9/18 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ КОМУ СВИДЕТЕЛЬС тся много ба ые снижаю а также им ющей среды миачного э ую субстан экстракте содержихих веществ, котоцелевого продуктагрязнение окружапродувки водно-амдержащими активта нигедазы.Цель изобрететической активнодукта, а также сн лластных суактивность ет место запродуктами стракта, соию фермения - повышение липолии и выхода целевого проение его себестоим-сти,ст иж Для достижения центрирование водн та фермента ос ул ьтрафил ьтра ции п менным разделение ции, одна из котор продукт с мол,м, 15 другая - пермеат, к на стадию экстракци та в смеси с водно-а соотношении 2:1. указаннои цели коно-аммиачного экстракуществляют путем ри 5 - 9 С с одноврем экстракта на фракых содержит целевой - 100 тыс.дальтон, а оторый рециркулируют и в качестве экстрагенммиачным раствором в ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР(56) Авторское свидетельство СССРМ 1118673, кл. С 12 й 9/18, 1982,Авторское свидетельство СССРМ 142090, кл. С 12 М 9/18, 1986.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НИГЕДАЗЫ Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения ферментного препарата нигедазы.Известен способ получения ферментного препарата нигедазы из семян чернушки амасской (И 9 еИа батазсепа 1.), предусматривающий измельчение сырья, обработу его ацетоном и экстракцию фермента из полученного ацетонового порошка водным раствором аммиака с последующей лиофилизацией целевого продукта.Наиболее близким к предлагаемому является способ получения ферментного препарата нигедазы из семян растений вида ЙдеПа багпазсепапредусматривающий активацию семян водой, измельчение их, обработку ацетоном, экстракцию фермента водно-аммиачным раствором и сублимационную сушку.Однако по известному способу получают нигедазу с недостаточно высокой липолитической активностью, поскольку в(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения ферментного препарата нигедазы. Цель изобретения - повышение липолитической активности и выхода целевого продукта, снижение его себестоимости. Способ заключается в том, что семена активируют водой, измельчают, обрабатывают ацетоном, экстрагируют, экстракт подвергают концентрированию ультрафильтрацией при 5 - 9 С и одновременно фракционированию на фракции, содержащие целевой продукт с мол,м, 15 - 100 тыс. дальтон и пермеат, который используют в качестве экстрагента в соотношении 2:1 с водно-аммиачным раствором. 2 табл, 1740417Способ заключается в следующем, Семена ЙцеПа бааазсепа. взвешивают и загружают в аппарат, имеющий термостатирующее устройство, Слой семян заливают водой и выдерживают при 37 + 2 С в течение 24 ч, проводят активацию семян. После этого воду сливают, влажные семена выгружают и подают на измельчение до частиц размером 0,3 - 0,4 мм. Измельченные семена загружают в аппарат и заливают ацетоном для их обезжиривания в течение 30 мин при 7 +2 С. После этого ацетон сливают, семена вакуумируют для удаления следов ацетона, Обезжиренные семена загружают в аппарат с мешалкой, в который подают десятикратный объем дистиллированной воды с добавкой водного раствора аммиака (экстрагент имеет рН 10,5), Процесс экстракции ведут при 5 - 9 С в течение 35 +5 мин, После этого содержимое аппарата подают на фильтрацию для отделения отработанных измельченных семян и получают слабый водно-аммиачный экстракт с содержанием сухого вещества около 1%. Полученный экстракт поступает на УФ-установку, где его подвергают концентрированию до содержания сухих веществ 8 - 8,5% при температуре экстракции 5 - 9 С с одновременным фракционированием и получением двух продуктов; целевого с липолитической активностью 750 Л Е/мг и мол,м, 15 - 100 тыс,дальтон и фильтрата, содержащего балластные вещества, не обладающие липолитической активностью, который возвращают на стадию экстракции семян в смеси с водно-аммиачным раствором в соотношении 2:1.П р и м е р 1. Семена в количестве 500 г экстрагируют смесью водно-аммиачного раствора в количестве 630 см и фильтрата в количестве 1260 см . Получают 1780 см экстракта с содержанием сухого вещества 0,96 о . Данный экстракт направляют на фракционирование и коцентрирование в УФ-установку полуволоконного типа с мембранами ВПУна основе фенилона, Эти мембраны задерживают растворение вещества с минимальной мол,м, 15 тыс.дальтон при селективности 98%. Процесс фракционирования и концентрирования осуществляют при 5 С и 0,015 МПа до содержания сухих веществ в концентрате 8,1% с переходом в фильтрат растворенных веществ с мол.м. 10 тыс,дальтон, не обладающих липолитической активностью и являющихся балластом, Полученный фильтрат в количестве 1580 см возвращают на стадию экстракции, целевой продукт в количестве 200 см с содержанием сухих веществ 8,1% изактивностью 750 ЛЕ/мг направляют на сублимационную сушку, которую проводят ступенчато при температуре от минус 45 до5 плюс 30 С. Из 700 см исходного экстрактао зполучают 6,7 г готового препарата с активностью 121 Л Е/мг, Из 200 см концентрированного экстракта получают 16,5 г готовогопрепарата с активностью 750 ЛЕ/мг. В10 фильтрат перешло 0,5 г растворенных сухихвеществ, не обладающих липолитическойактивностью, Таким образом, при повышении липолитической активности препаратав 6 раз удельный выход его с единицы высу 15 шиваемого сублимацией экстракта увеличился с 6,7:0,7 = 9,57 г/дм до 16,5:0,2 = 82,5г/дм, т,е. в 8,62 раза. Соответственно в 8;62раза сократятся энергозатраты на сублимационную сушку.20 П р и м е р 2. Процесс экстракции исушки ведут по примеру 1, а фракционирование и концентрирование осуществляютна УФ-установке с мембранами ВПУнаоснове фенилона при 9 С до содержания25 сухого вещества 8,0 о . Эти мембраны задерживают растворенные вещества с минимальной мол.м. 50 тыс,дальтон, Целевойпродукт имеет активность 520 ЛЕ/мг, афильтрат - 240 ЛЕ/мг, Из 700 см исходного30 экстракта получают 6,8 г готового продуктас активностью 124 ЛЕ/мг, из 140 см концентрированного экстракта получают 11,5 гготового препарата с активностью 520Л Е/мг. В фил ьтрат перешло 5,5 г растворен 35 ных сухих веществ и его липолитическая активность составила 240 ЛЕ/мг, чтонедопустимо.П р и м е р 3. Процесс экстракции исушки ведут по примеру 1, а фракциониро 40 вание и концентрирование осуществляютпри 7 С до содержания сухих веществ 8,0 о на УФ-установке с мембранами ВПУизфенилона. Эти мембраны задерживают растворенные вещества с минимальной мол.м.45 100 тыс,дальтон,Из 700 см исходного экстракта получазют 7 г готового препарата с активностью 126ЛЕ/мг, Из 30 см концентрированного эксзтракта получают 2,5 г готового препарата с50 активностью 12 Л Е/мг. В фильтрат перешло14,5 г растворенных сухих веществ и еголиполитическая активность составила 124ЛЕ/мг, т,е. практически все растворенныевещества, определяющие активность пре 55 парата, перешли в фильтрат. Таким образом, верхний предел молекулярных массрастворенных веществ, определяющих активность препарата, составляет 100тыс,дальтон,1740417 Указанные параметры являются оптимальными, так как, если вести процесс фракционирования и концентрирования до содержания сухого вещества, с мол.м. менее 15 тыс. и более 100 тыс,дальтон, то в целевом продукте накапливаются балластные вещества, что снижает активность препарата. Балластные вещества с мол.м, свыше 100 тыс.дальтон при концентрировании свыше 1 О сухих веществ слипаются и образуют коллоидную фазу, которая отделяется на стадии предварительного фильтрования. Температура 5 - 9 С является также оптимальной, так как при температуре меньше 5 С резко снижается скорость ультрафильтрации, а при температуре выше 9 С снижается стабильность нигедазы-субстанции вследствие ее закисания.В табл, 1 и 2 приведены показатели процесса,Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает высокий выход продукта с высокой липолитической активностью,Таблица 1 Степень концентрирования, содержание сухих веществ в концентрате, % Фильтрат Целевой продукт 15 50 20 50 100 150 200240 126 126 120 100 12 100 12 7 20 24 16 0,5 Степень фракционирования, максимальная молекулярная масса растворенных веществ, перешедших в фильтрат, тыс.дальтон Температура, С 5 Время хранения, ч 40 0,7 1,1 2,8 3,6 5,4 6,4 7,2 8,3 0,96 2,4 3,7 5,0 6,2 7,4 8,1 0,94 1,6 2,8 4,2 6,0 7,2 8,0 0,98 3,2 5,8 7,0 80 Формула изобретения Способ получения ферментного препарата нигедазы из семян растений вида йде 11 а бавазсепа , предусматривающий 5 активацию семян водой, измельчение их,обработку ацетоном, экстракцию фермента водно-аммиачным раствором, фильтрование, концентрирование. и сублимационную сушку экстракта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, 10 что, с целью повышения липолитической активности и выхода целевого продукта, а также снижения его себестоимости, концентрирование водно-аммиачного экстракта фермента осуществляют путем уль трафильтрации при 5 - 9 С содновременным разделением экстракта на фракции, одна из которых содержит целевой продукт с мол.м. 15 - 100 тыс.дальтон, а другая - пермеат, который 20 рециркулируют на стадию экстракции вкачестве экстрагента в смеси с водно-аммиачным раствором в соотношении 2:1. Липолитичечкая активность, ЛЕ/мг 112 125 160 200 250 280 310 350 121 240 350 470 560 690 750 118 150 220 300 400 470 520 126 126 126 124 1241740417 Таблица 2 Составитель Э,ШахтимирТехред М.Моргентал Корректор О,Кравцова Редактор Т.Лазоренко Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 2051 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5