Способ иммобилизации ферментов

(23) Приоритет осудврственнын ноцвтетСоввтв Мнннстров ИСРпо делам нзобретеннйи отнрытнй 02.77.Бюллетень М 52) Авторы изобрет ер, М. А. Аль. С, Егоров и аранора ии Заявитель 54)СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЫИИ ФЕРМЕНТО Изобретениечехия иммобилинаходят широкническом синте ится к способу полупцленнэсти. Известны спр на носител обы иммобилиза ции фермен- р механили мерные ях, заключаюшие и ферментор рческом вклгели 1 Ц .Известе чен роды; нения достаток изр нертность мнрепятструюц. ое рымырани ичес-Мриа быст ае,с ним н нах е и химически не сряза эскорский ордена Ленина государственный унирер зоранных ферментов, которыеое применение р тонком оргазе, медицине, пищерой прон также способ коралентного срязыьаниа фермента средрарительной актива-, цией носителя посредством обработки последнегэ пиангалогенидами р шелочной среде 2, Однако этот способ применим только для активации носителей полисахариднэй приа используемые для активации соедиявляются отрарляюшими веществами. естных способов - хогих полимерных маая связыванию, а также фермента р том сл эрдена Трудорогэ Красного Знаментет имени М. В. Ломэносора По предлагаемому способу фермент предрарительно ацилируют хлорангидридом ненасышенной кислоты,Пропесс иммобилизации проводят путем актирации фермента ацилироранием хлорангидридом ненасыщенной кислоты и пэследуюшей совместной пэлимеризации ацилирэваннэго фермента с ненасышенным полимеризуюшимся мономером или с ненасышенным полимеризуюшимся мономером и сшираюп.им агенСтадию ацилиоорания прорсдят при рН 6,0-9,0., предпочтительно 7,0-8,0, при температурс обычно 0-40 эС и при мольном сэотношении фермент/хлорангидрид ненасышенной кислоты 1:10-1000. Реакцию сопэлимеризации ацилироранного фермента с ненасыдценными мономерами проводят при 0-60 эС под действием инициаторор радикального типа. В качестве хлорангидрида ненасыщенной кислоты используют хлорангидриды акрилорой, метакрилорой и других мононенасьпценных кислот, р качестве мономера применяют акриламид, метакриламид, И -винилпирропщон и т.пр качестве сшираюшегоагента И, т 4 -метиленбисакриламид, диэфирыакриловой к метакриловой кислот с двухатомными спиртами, а В качестве книциаторов полимеризации - ркбофпавин, перекисьбензоила и др.ЬП р к м е р 1, Ацилкрованке трипсинапроводят при ООС путем добавления к раствору 50 мг трипсина в 50 мл бикарбонатного буфера при рН 8,0, 0,05 мл хлорангидрида акрпловой кислоты, После добавления рвсего количества хлорангидрида раствор перемешивают 15 мин. Затем к ацилированному трипсину добавляют 50 мг акриламкда ксополимеоизацию проводят в вакууме при20 ОС, используя в качестве инициатора полк-меризации рибофлавин, концентрация которого 1 ) ,цг лд Продгктыт сополимеокзаттик Оаз.:дедля,г;, гельильтрдцией на Сефадексе .: 50,используя колонку 1,2 х 60 смд дтлюцию растворов проводят 0,0 М тряс, ацетатным ОуферО При рН 3, 5. П)эодуюты сополимериза-ции после разделения идентифицируют спектрофотометрическк, гравиь етрически послеосаждения ацетоном при -)2 ООС и путем ОпреДЕЛ, .ИЯ ПРОТЕОЛИТтИЧЕСКОй аКтИВНОСтк В Каждой фракции, Сополимер ацилировакного трип-.сина т. акриламидэм выходит их хроматографичоской холопки раньще других компонентовПОЛП;,тгрИЗуЮШЕйся СИСТЕМЫ, ПРИЧЕМ ВЫХОДсополимера увеличивается с увеличением вре-Оменя сополимеризацки. Сополимер ацклированного трипсина с акриламидом является линейным сополимеромпредставляет собой твердое Вешество, растворимое В воде.Г р и ч е р 2. Иммобилкзацию трипсина Юпроводят ПО примеру 1. Количество добавля-.емого к растьооу 50 мг ацилированного трипсина в 50 мл бикарбонатного буфера, при рН6,0 акриламида равно 100 мг,П р и м е р 3. Иммобилизацию трипсина 40проводят по примеру Х. В качестве сомоноуорд 1 В тСПО,:т;-,.-.ПОТ С т":гсв Э О МКркдЧЫЬфкдаи 5 мг Й, " "-исметкленакркламида.П р и м е р 4, Иммобилизацию а -химотрипскна проводят по римеру 1. Ферментиз геля не вылывается.П р к м е р 5, Иммооилизацию трипскна,проводят по примеру 1 В качестве сомономера используют й -вянилпирролидон, а вкачестве инициатора полимеризации Я, 4, Л,Й-ТЕтРаМЕТЯЛтЗТИЛЕКДИаМИН СОВМЕСТНО С ПЕРсульфатом аммония. Реакцию сополимеризацик проводят прк 36 ОС,П р к м е р 6, Иммобктлизацкю ферментарт 5 ВОдят ПО ПрИМЕру 3 В КаЧЕСТВЕ ( ШиваКтьщегс агзнта используют дкзфио зтиленгли;коля ;:;:гтакоичовои кислоты. с.ео.ент из,-д, е тдтг;., 1 Опапгнтв т О,ВЯЗЫВ,.:т;ИЯ МОЛЕКУЛ ЕРМЕНТа С ПМПтЕОНМ НОСИТЕЛгМ О Т Л Иа ю ю, и й с я тем, что, с целью повы -шения стабильности феомента и гго активности, последний прйдварительнО ацилируютХЛОРаНГИЦПИДОМ НЕВА"5 ЦДЕННГРт КИСЛОТЬт ПОИдОЯ О Одд,рС ПОС 1 гттуЮпт 1 гй Стп ОЧИгокзацк,Ей апклкод;заико, О фЕР ЕНта С ттгиас тШЕНН 1 МттаЛИМЕРИЗУЮШИМСЯ МОНОМЕРОМ,2,т,посоопоп. 1, Отличаюш и й с я тем, что пооцесс сопэлимгризаЦУИ ВЕДтВ П)ястттсТВИИ СЩВаК)ЩЕГО аГЕНтаЗ.Стособпопд 1, этличаю -Ш И Й "= ЧТО ППОтптС СОПОЧттМЕОИЗа -ции Ведт:т тгои 0-60 ОС,Ис чп фогринят 1 во вн -мание при зкспертизг:3., Эероп 1 Т,Мттап Т,В В,А 1970, 212,3622,АХтп , Рос 1 Ь 7,рт 3 йсХ 5 ЙОот 81887, 23.4, р 302 (прототип).Сос тявдттель А. Бочаров Редактор О. Филиппова Техред А. Богдап Корректор П. Боркнская Заказ 253/4 Тираж 569 ПодписноецНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССРпо делам изобретений и открытий.1 13035, Москва, Ж, Рау нская наб д. 4/5Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул, Проектная, 4