396014

ПИСАНИЕ ЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Социалистицеских РеотубликК ПАТЕЙ исимыи от патента Заявлено 30,1 Ч,1971 (ЛЬ 1654637/31-1Государственный комитет Совета Министров СССР оо делам изобретений и открытийлетень3 публиковано 28.Ч 111.1973. Бю ата опубликования описания сДК 57.154.52(088.8).ХП.197 Авторыизобретени Иностранцы арл Герман Гоффман, Джон Уильям и Стюарт Рой Мичелсоиотро Иностранная фирма Мерк энд Ко, ИНКоединенные Штаты Америки) Заявитель ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНУ ТИДФОСФОР ИЛАЗЪ Изобретение относится,к биохимии, аименно к способам получения полинуклеотпдфос,форилазы.Известен способ, получения полинуклеопидфосфорилазы, заключающийся в том, что суспензию клеток Мгсгососсцз 1 узойей 1 гсцз лизируют лизоцимом. Из беоклеточного экстрактацелевой продукт выделяют, осаждая частьбаллаепных белков сернокислым а,ммонием(до 30/о), из надосалочной жидкости ферментосаждают 30 - 65%-ным сульфатозг амегонияи далее очищаеот ионообменными целлюлозами, сефадексами. Полученный препарат используют для синтеза в стационарнык условиях полину 1 клеотидов.Целью предложенного изобретения являстся получение водонерастворимого фермента.Поставленная цель достигается тем, чтоочищенный пректарат полинуклеопидфосфорилазы сме 1 шивают с целлюлозой, активированой галогенциансм,П р и м е р 1. Ферментативную среду, имеющую следующий состав (г): Р 11 со дрожжевойэкстракт 4670,0, МАЗО, 7 Н,О 186,8, Л 1 аС 1 9,3,Ре 804 7 Н,О 9,3, Мп 804 4 НО 7,4, ХаНСОз3959,6, декстрозы 9340,0 воды до 467 л, стерилизуют, засевают 1,5 л культуры Мгсгососсцз1 узос 1 ей(гсцз (М. 1 ц 1 ецз, АТТС4698) иинкубируют с перемешиванием и аэрацией при28 С в течение 20 час (посевной материал выращивают на той же среде при 28 С в течеиве 36 час 1 г. Затем содержиетое ферзгентера быстро охлаждают до 0 - 5 С и центрифугируют, поддерживая ту же температуру. Надосадочную жидкость сливают, а оклаждеггнуго клеточную массу весом около 1,5 - 2,5 кг ресуспендируют в 0,5%яном ледянозг растворе хлористого натрия, используя около 1 л раствора хлористого натрия на каждый килограмм клеточной, массы.К полученной суспензии при температуре, поддерживаемой на уровне 0 - 5 С, и перемешивании добавляют 1 мл 2-егеркапто-этаогольного антиоксиданта, процеживают через марлю, в результате чегго удаляют неразбитые комки, которые затем повторно обрабатывают. Полученную суспензию трижды гомогенизируют, охлаждая перед каждой гомогениза цией до 0 - 5 С, при давлснпп 562,48 кг/слгманометру, в результате чег происходит разрушение клеток. Затем гезго-.еннзированы ю суспензию цеьчтрифугируют в - .ечение 40 лгин при 11000 д, осадок удаляют, а прозрачную 25 надосалочную жггдкость замсраживают.Анализ налосалочной жидкости песазывает, что солержачие белоа составляет 3,6 мг/мл, активчость полинуклеотидфосфорилазы (ПНФазы) около 005 ед/.цл; 0,014 ел.30 11 НФазы/мг белка.Редактор Д. Пинчук Заказ 693/2275 Изд Л"е 944 Тираж 467 Подписное Ц 11 ИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушскаи наб., д. 4/5Тин. Харьк. фил. пред. Патент К 130 лгл размороженной надосадочной жидкости, содержащей 24 ед. ПНФазы и охлажденной до 0 - 5 С, медленно, добавляют при перемешивании 31 г твердого серцокислого аммония, образовавшуюся смесь перемешивают в течение 20 лгин, центрифугируют при 23000 о 30 чин и осадок удаляют.К гга 1 досадочггой жидкости в объеме 140 лг,г медлеггно добавляют при перемешиваьгии 75 лгл ВВА этаггола, доводя его концентрацию до 35%, в результате чего проис. солит осаждецие ПНФазы, Послученную водно-этанольную смесь перехгешивают при 0 - 5 С в течение 20 лгигг, а затем центрифугируют при 23000 д 35 лгин, в результате чегго происходит отделение осажденной ПНФазы, надосадочную жидкость отбрасывают.Осажденную ПНФазу растирают в небольшом объеме (5 - 20 лгл) охлаяденного (5 С) ПНФазного буфера, имеющето следующий состав: 10 лгл 1 М трис-гидроксиметил/-аминометан НС раствора, 1 лгл 1 М распвора уксуснокислого магния, 0,07 лгл тиоэтанола, дистиллированную воду доводят до 1 л и рН буфера до 8,2. Образующийся раствор затем диализируют при 5 С в течение 15 лгин против свежего ПНФазного буфера. Диализат осветляют центрифугираванием, поддерживая температуру около 0 - 5 С, и прозрачную цадосадочную жидкость разливают в бутылки, замораживают и хранят в замороженном состоянии.П р и м е р 2, 20 г порощка целлюлозы смешивают с четырьмя следующими друг за другом порциями двух объемов деионизированной воды, причем после каждой порции смесь отстаивают и надосадогчную жидкость сливают.К полученной суспензии добавляют 500 лг,г 5 Х водного раствора едкого натра, и смесь осторожно перемешивают в азотной атмосфере при 0 С в течение 15 час, Водный раствор щелочи отделяют от порошка целлюлозы декантацией с последующей фильтрацией через крупнопо 1 ристую пластинку (без применения всаеывания) с разрежающей промывкой деионизироваиьпой гводой.Промытый осадок гмер 1 серизирсванной целлюлозы доводят до объема 600 лгл дооавлением деионизированной воды. 3 лг г этой мерсеризированной целлюлозы целгтрифугиругот и 2 лгл супернатанта декантируют с получением приблизителыно 50 г сухого эквивалента в 1 мл остававшегося осадка, который охлаждают до 0 С. Около 150 лгл броициана обрабатывают 2 лгл воды, и раствор растирают с максимально возможной быстротой. Водный раствор бромциана сразу объединяют с охлажденной водной смесью згерсеризированной целлюлозы и добавляют при перемешивании достаточное количество 5 Х вОдного раствора едкого натра (около 0,1 - 0,2 лгл) для доведения рН,до 10 - 11,Получеяную активнрованггуго целлюлозу немедленно промывают в маленькой фильтровальной воронке сначала ледяной водой, затем охлажденныуг 0,1 М водным раствором бикарбоната натрия, снова ледяной водой и дваокды ПНФазныьм буфером (0,01 М), который имеет следующий состав: 10 лг,г 1 М трггс-/пидроксиметил/-ахгино-метаи НС 1 раствор, 1 лл 1 М раствора уксуснокислого магния, 0,07 лгл тиоэтанола, добавляют дистиллированную воду для доведения общего объема до 1 л и рН согеси доводят до 8,2. Промытую активироваггную целлюлозу смешивают с 2 лгг ПНФазного буфера. Эту смесь активированной целлюлозы (содержащую 50 лгг,волокна сухой эквивалент) объединяют в це 1 нтрифужной пробирке с 1 лгл ПНФазы с приблизительной активностью 1 ед ( единица активности ПНФазы обозначает то количество энзиматччеоки активного белка, которое в 1 лгин полимеризует 1 лглголь нуклеозиддифосфата в нерастворимый в кислоте полимер при 37 С и субстратцой концентрации 1 лглголь/лгл. Пробирку,промывают азотом, и смесь медленно перемешивают при 5 С в течение 15 час, центрифугируют и дважды промывают порциями по 2 лгл свежего ПНФазного буфера. Полученный ковалентно связанный энзиматический ПНФазпый катализатор суспендируют 2 лг,г ПНФазного буфера, и суспензию хранят при температуре 0 С, 1 лгл этой суспензии дает адекватный уровень полимеризации с 1 до 0,06 М раствора нуклеозидгдифосфата. Способ получения полинуклеотидфоофорилазы из суопензии клеток Мсгососсцз усодеЖсцз (М. п 1 епз), путем лизиса лизоцимом, фермент выделяют из бесклеточного экспракта и очищают, отличающийся тем, что, с целью получения водонерастворимого фермента, очищенный препарат полинуклеовидфосфорилазы смешивают с целлюлозой, активированной галогеццианом.