Способ получения фитопреципитина

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик395085 детельст висимое от Заявлено 18.Ч 1.,1971 (И 1671с присоединением заявки М -9/31-1 И, Кл. А 611 23 Государственный номитет Совета Министров СССР по делам изооретений и открытий,Ч 111.1973, Бюл -ете" ье 2,398,188.8) публиков ата опубликования описания 4.Х 11 А 97. Авторыизобретения М. Д, Луцик и И, И, Литвинвовский государственный медицинский институт вител СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ фИТОПРЕЦИПИТИНА поий саИзобретение относится к области бактериологии и биологии.Известен способ получения фитопреципитина, согласно,которозгу гороховую муку экстрапируют раствором хлорида натрия, центрифугируют, осаждают белок добавлением этанола, центрифугируют, добавляют 2 н. раствор 4 Х 1 аОН до РН 7,5, лиофилизируют. Полученный преципитин не требует адсорбирования. Однако, фитопреципитин гадким способом получают в аморфном аиде.Цель изобретения - получение фитопреципитина в кристаллическом, виде, что повышает его качество.Это достигается тем, что белок осаждают сульфатом аммония в иислой среде, адсорбируют,на декстрановом геле из фосфатного буфера, содержащего 1% хлористого нагрия, рН 7,5, элюируют тем же буфером с добавкой 0,5 ноль глюкозы с последуюпоизг,переосаждением и кристаллизацией из спирто-водного раствора при рН 5,6 и температуре 4 - 5 С.При м ер:1, Вьсаливание. 0,5 кг муки из лущенного гороха экстрапуют 1,5 л 1 огг,-ным растворовг хлористого натрия 4 час,при перемешивалии и затем центрифугируют 15 мин.2. Выса,гивание алияониг 1 сульфатом, К лученному экстракту добавляют адамон сульфат до О,З насыщения (19 г/100 лл), о док удаляют центрифугированиезг 15 .чан.при 3000 об/лгин. К надосадочной жидкости добавляют авгзгоний сульфат до 0,6 насыщения (20 г/100 гял) и осадок, содержащий цре ципитин, собирают центрифугированиезь Выход составляет 28 г белка.3. Высаливание в кис гой среде, Осадокбелка, полученный на гвредыдущей стадии, растворяют в 50 я,г воды, добавляют 1 н. со О ляной кислоты до рН 2 - 2,5 (около 0,1 объема) и иззгеряют общий объем раствора. Вычисляют степень насыщения амхьоний сульфатом (насыщение осадка принимают равным 0,6) и добавляют насыщенный распвор азгзго 1 ь ний сульфата до 0,3 насыщения. Осадок удаляют центрпфугированием. К надосадочной жидкосги добавляют твердый а м молний сульфат до 0,6 насыщения. Осадок собирают центрифуггированием и подсушивают на воронке 20 Бюхнера. Выход составляет 5 г белка.4. Адсорбиия на геле Сефадекс Г,Осадок белка растворяют в 15 - 20,и.г,воды и нейтрализуют едким натроьм до рН 5,6. Затезг раствор разбавляют водой в 4 раза и образовавшийся осадок через 30 .яин удаляют ценгрвпфугированием. Надосадочную жидкость доводят до рН 7,5 едкизг натрозг и наносят на,колонку размером 10 Х 20 ся, заполненную гелевг Сефадекса и уравновешенную зп 0,03 м фосфатным буфером, содержапоихг 1",оЗо 5085 П р едмет из о бр етения 5 Составитель Т. Головина Техред Е. Борисова Корректор В. Жолудева Редактор Д. Пинчук Заказ 689/227 Изд. Мц 940 Тираж 467 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж.35, Раушская наб д. 4/5Тип. Харьк. Фил, пред. Патент хлористого натрия, рН 7,5. Колонку промывают буфером до исчезновения белка в элюате. Фитопреципитин, адсорбированный на геле, элюируют там,же буфером, к которому добавляют глюкозу до 9 (0,5 ноль). Вытекающую жтдкость собирают на,коллекторе фракции и пробы, содержащие, белок, объединяют, Фитопрецпгтин элюируют в объеьме 150 - 200,ял; его осаждают амьмоний сульфатом при 0,6 насыщения. Выход - 0,25 г беляка.5, Кристаллизаиия. Для удаления неорганичепсих,солей (аммоний сульфат) осадок преципитина (0,25 г) растворяют в 5 гпл воды, устанавливают,рН 5,6 помощью 1 н. уксусной кислоты. Затем постепенно добавляют 1,5 объема этанолане допуская подъема температуры выше 20 С, для чего посудпну со смесью оьхлаждают водопроводной водой. Осадок центрифугируют, растворяют в 5 ли воды и повторно осаждают этанолоу. После вторияного центрифугирования осадок растворяют в 4 лл воды, раствор осветляют центрифупированием прои 7000 об/лин и оставляют при 4 С на 24 час, При стоянии выпадают кристаллыкоторые имеют форму тетраэдров с выпуклыпи гранями.б. Перекристаллизаиия. Кристаллы растворяют в воде при рН 8 (концентрация белка 3 - 4 о/о), небольшую муть удаляют центрнфунированием, после чего рН доводят до 5,6 дооавляют несколько капель спирта, Оставляют,на 24 час при 4 С,5 Количество получаемого бе,тка составляет400 в 5 яг из 1 кг гороха, степень очистки 150 раз.Все операции, кроме специально указанных, провозят г 1 ри комнатной температуре. О Активность приципитина на разлкиных стадиях очистки контролирьуют методом гемаглютинации в проб.ирках. Способ получения фитопрецилитина путемэкстракции гороковой муки раствором хлор- да натрия, осаждения беляка и его очистки, отличающийся терм, что с целью повышения 20 качества целевого продукта, белок осаждаютсульфатом ааьмония,в кислой среде, адсорбируют,на декстрановом геле из фосфатного буфера, содержащего 1% хлористого натрия, рН 7,5, элюируют тем же буфером с добав кой 0,5 моль глюкозы с последующим переосаждением и кристаллизацией из спирто- водного раствора при рН 5,6 и температуре 4 - 5 С.