Способ определения антигена в растворе

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ .ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ВИДЕТЕЛЬСТВ ВТОРСКО М 9сударственный универсиа и Кооператив "МедсерС. М. Быстряк, С. П. Смотин Вопросы4., химии мунодиагрментным ых и небелы крови, и рдиологии, е для диагих состоявстия - повышение чсти определения.вляется следующи бо антитела, вступающие ю, метят пероксидазой. плекс антиген-антитело, азой, подвергают взаиогеном - о-фенилендиаии перекиси водорода, ЦИЮ КИСЛОТОЙ И ПО ОПТИ- рашенного раствора опнтрацию антигена в(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНАРАСТВОРЕ Изобретение относится к им ностике, в частности к иммунофе способам специфических белков ковых антигенов в пробе плазм может быть использовано в ка хирургии и клинической медицин ностики различных патологическ ний. Цель изобретен вительности и точноСпособ осущест разом,Предварительн в иммунную реакци Образованный ком меченный пероксид модействию с хром мином в присутств останавливают реак ческой плотности ок ределяют конце Ы 1718119 А 1505 6 01 й 33/531(57) Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии,. и может быть использовано для определения антигенов в крови, Цель изобретения - повышение чувствительности и точности способа. Для этого антиген определяют в реакции ферментсубстратного взаимодействия, при этом взаимодействие комплекса антиген-антитело, меченного пероксидазой, с о-фенилендиамином в присутствии перекиси водорода проводят в темноте в течение 15 мин, затем реакционную смесь облучают светом при 420 - 460 нм до появления окраски, а после остановки реакции фотометрируют. исследуемой пробе, причем взаимодейстъф вие комплекса антиген-антитело, меченного пероксидазой, с о-фенилендиамином в присутствии перекиси водорода проводят в темноте в течение 15 мин, затем реакционную смесь облучают светом при 420-460 нм д до появления окраски, а после остановки ("Д реакции фотометрируют при 492 нм, дП р и м е р 1. Определяемым антигеном является миоглобинспецифический белок, входящий в состав мышечных клеток, Для анализа использовали предварительно обработанный антителами к миоглобину и 1;ь-ной лошадиной сывороткой полистироловый й планшет, хранящийся при -10 С, В лунки планшета вносили по 50 мкл растворов миоглобина - стандарта (от 1,25 до 160 нгlмл), Одновременно в свободные лунки вносили анализируемую пробу сыворотки крови, разведенную в 10 раз 0,05 М фосфатным буфером рН 7,2. Растворы миоглобина-стан 1718119дарта и пробы инкубировали в течение 30 мин при 37 С. После отмывки водой в каждую лунку добавляли по 150 мкл разведенные 1:500 меченные пероксидазой антитела к миоглобину человека в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,2 и инкубировали в течение 30 мин при 37 С. Полученный комплекс миоглобин-антитело к миоглобину (комплекс антиген-антитело), меченный пероксидазой, использовали для измерения ферментативной активности, Для этого в каждую лунку добавляли по 50 мл субстратной смеси, содержащей о-фенилендиамин и перекись водорода, и помещали планшет в камеру без доступа света и выдерживали в темноте в течение 15 мин. Затем планшет извлекали из камеры и помещали под ртутную лампу типа ДРШ, излучающую свет через светофильтры типа ШССС 5. Спаренные светофильтры этого типа позволяют пропускать свет лампы только в диапазоне длин волн от 420 до 460 нм, Облучение реакционной смеси при 420 - 460 нм производили до получения окраски растворов в лунках планшета. После развития окраски ферментативную реакцию в лунках останавливали добавлением в них по 50 мкл 50; серной кислоты, а затем измеряли оптическую плотность полученных растворов в спектрофотометре типа Мультискан при 492 нм. По результатам оптической плотности растворов-стандартов строили калибровочную кривую и по ней рассчитывали концентрацию миоглобина в испытуемой плазме крови. Ее значение составило 56,8+2,7 нг/мл.П р и м е р 2. Определяли гаптен-медиатор симпатической нервной системы норадреналин, Для анализа использовали предварительно обработанный антителами к норадреналину и 1 ф лошадиной сывороткой полистироловый планшет, хранящийся при 10 С. В лунки планшета вносили по 50 мкл растворов норадреналина-стандарта (от 0,05 до 50 нг/мл). Одновременно в свободные лунки вносили анализируемую пробу крови, разведенную в 5 раз 0,05 М фосфатным буфером рН 7,2, затем добавляли в лунки по 50 мкл разведенный 1:100 меченный пероксидазой норадреналин и инкубировали в течение 30 мин при 37 С, Полученный комплекс норадреналин-антититела к норадреналину (комплекс антигенантитело), меченный пероксидазой, использовали для измерения ферментатив 5 10 15 20 25 30 35 40 45 .50 55 ной активности. Для этого в каждую лунку добавляли по 50 мкл субстратной смеси, со- держащей о-фенилендиамин и перекись водорода, и помещали планшет в камеру без доступа света и выдерживали в темноте в течение 15 минЗатем планшет извлекали из камеры и помещали под ртутную лампу типа ДРШ, излучающую свет через светофильтры типа ШС+СС 5 в диапазоне от 420 до 460 нм. Облучение реакционной смеси светом при 420 - 460 нм производят до получения окраски растворов в лунках планшета, После развития окраски ферментативную реакцию в лунках останавливали добавлением в них по 50 мкл 50 серной кислоты, а затем измеряли оптическую плотность полученных растворов в спектрофотометре типа Мультискан при 492 нм, По результатам оптической плотности растворов-стандартов строили калибровочную кривую и по ней рассчитывали концентрацию норадреналина в испытуемой плазме крови, Ее значение составило 2 нг/мл,Помимо плазмы крови в качестве биологического объекта определения концентрации антигена предлагаемым способом может быть использована сыворотка крови или цельная кровь.Чувствительность (минимальный порог определения) предлагаемого способа составляет 1,25 нг/мл, в то время как для способа-прототипа чувствительность составляет около 10 нг/мл. По статистическим данным коэффициент вариации для предлагаемого способа в 3,3 раза меньше, чем для прототипа. Это свидетельствует о повышенной точности предлагаемого способа, .Формула изобретения Способ определения антигена в растворе путем взаимодействия комплекса антиген-антитело, меченного пероксидазой, с хромогеном - о-фенилендиамином в присутствии перекиси водорода, остановки реакции кислотой, фотометрирования при 492 нм и определения концентрации антигена по оптической плотности исследуемой пробы, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности и точности способа, взаимодействие фермента с субстратом осуществляют в темноте в течение 15 мин, затем реакционную смесь облучают светом при 420 - 460 нм до появления окраски.