Способ определения липидов в сыворотке или плазме крови

(51) 4 С 33 ИДОВ В СЫий ворк Ч., 1.62 СО 1 ОЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК УДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬТИЙ(71) Всесоюзный кардиологиченаучный центр АМН СССР(56) Л, СЬгоааодтарЬу, 1979В 3, р.281-292,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ(57) Изобретение отномни. Цель изобретенияточности способа. В сплазме крови осуществный ферментативный гищих липидных компоненния маскирующих пикирина триглицеридов ихпазами до свободногоных кислот, Затем просыворотки перед хромаанализом и на основандельных липидов опреношения. 3 з.п. ф-лы. сится к биохи - повышение ыворотке или ляют иэбирател дролиз маскирую тов. Для удале эфиров холестегидролиэуют лиглицерина и жирводят обработку тографическим ии площадей от-. деляют их соотИзобретение относится к биохимии липидов и может быть использовано в медицине, в частности в исследовании липидного обмена и патогенеза атеро 5 склероза.Цель изобретения - повышение точности способа за счет предварительно. го ферментативного гидролиза балластных липидов. 10Способ осуществляют следующим образом.В сыворотке или плазме крови перед анализом липидов методом хроматографии осуществляют избирательный Фер ментативный гидролиз маскирующих липидных компонентов. В зависимости от того, какие липиды необходимо уда-. лить, применяют различные ферменты. Например, для удаления маскирующих 2 О пики эфиров холестерина триглицеридов их гидролизуют липазами до свободного глицерина и жирных кислот. Для удаления эфиров холестерина используют холестеринэстераэу, а для 25 удаления Фосфолипидов различные виды Фосфолипаэ. Образующиеся при ферментативном гидролизе соединения имеют резко отличающиеся от исходных хроматографические свойства и уже не ме шают определению нужных липидов.Исследуемую сыворотку или плазму крови обрабатывают препаратом липолитического фермента (липаэа, холестеринэстераза или фосфолипаза), после чего проводят обычную обработку сыворотки перед непосредственно хроматографнческим анализом. На основании площадей отдельных липидов определяют их соотношения. 4 ОП р и и е р 1. 25 мкл сыворотки крови человек,:. смешивают с 5 мкл препарата микробной липазы (удельная активность 500 ед/мл по гидролизу коммерческой эмульсии кокосового мас ла "Интралипнд" Фирмы "Витрум", 51 вефция) и прогревают ври 38 С в течение 20 мин. Затем добавляют 300 мкл изопропилового спирта, энергично встряхивают, центрифугируют при ЗООО об/мин в течение 30 мин, 20 мкл раствора вводят в колонку (4,5 х 250 мм) для хроматографии в обращенной фазе (ЛйгазрЬег 008, "Алтекс", С 111 А) ивроводят злюцию системой растворителей нзопропанол - ацетонитрил (65:35 по объему). Детектирование липидов (эфиры холестерина и стероидов) проводят при 205.нм. На хроматограммах липидемической сыворотки без обработки липазой и после обработки липазой перед экстракцией видно, что индивидуальные хорошо разрешенные пики, соответствующие эфирам холестерина, полностью замаскированы гораздо более, интенсивными пиками триглицеридов. Трчность определения этих эфиров без обработки липазой с трудом поддается оценке; во всяком случае, общая погрешность превышает 1007. После обработки липаэой общая погрешность определения данных эфиров холестерина составила 4-6 Ж.Концентрация определяемых эфиров холестерина - арахидоната и эфира эйкозапентадиеновой кислоты - составляла в исследуемой сыворотке 0,58- 0,19 ммоль/л соотетственно.П р и м е р 2. 25 икл плазмы крови человека смешивают с 10 мкл препа-, рата микробной холестеринэстеразы(удельиая активность 20 ед/мл по гидролизу пальмината холестерина, солю- . билизированному лецитином и.таурохолатом натрия) в буфере, содержащем неконные детергенты (тритон Х, Бриджи т.п.), и прогревают прио37 С в течение 30 мин. Затем добавляют 300 мкл изопрогилового спирта, энергично встряхивают, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. 20 мкл полученного экстракта вводят в хроматографическую колонку (4,.6 х 250 мм) для хроматографии в обращенной фазе Я 1 газр 1:ег ООБ, "Алтекс", США) и проводят элюцию в . системе растворителей изопропанол ацетонитрил (70:30 по объему), Детектирование липидов проводят при 205 нм,В данном случае повышается точность определения ацилглицерина, концентрация которых по глицерину 0,18 ммоль/л, Погрешность его огределения уменьшается с 10-12 до 5-6 Х, Изменение времени выхода пиков связано с увеличением полярности подвижной фазы.П р и м е р 3. 30 мкл сыворо=ки крови человека смешивают с 10 .:.кл препарата микробной фосфолипазы(смесь Фосфолипаз А., С и О) Удельная активность фосфолипазы составляла 500 ед/мл, фосфолипазы Сед/мл а фосфолипазы В - 35 ец/мл. Определение активности Фосфолипаз проводилось по гидролизу лецитина.13777.3 Формула изобретения Составитель Н. ГуляеваТехред Л.Олийнык Корректор О. Кравцова Редактор Э, Слиган Заказ 865/40 Тираж 847 ПодписноеВНИИПИ Госуд,",рстненного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.М 5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул, Проектная, 4 После добавления препарата ф рмен - та сывороткужнкубируют при 370 пС н течение 30 мин, добавляют 300 мкл . изопропанола, энергично нстряхива 5 ют и центрифугируют при 3000 об/мин н течение 30 мин20 мкл полученного экстракта вводят н колонку для хрсматографии (4,6 х 150 мм) с силихагелем и проводят элюцию системой растворителей гексан - изопропанол - вода (9:8:1 по объему). Детектирование липидов проводят при 205 нм. Общая концентрация моноглицеридов в исследуемой в данном примере сыворотке сос тавляла 0,45 ммоль/л по глицерину. Ошибка определения холестерина и ацилглицерина без обработки фосфолипазами превьппает 100 ., с обработкой составляет 3-5%. Погрешность опреде" 20 ления ацилглицерина без обработки ферментами составляет 25-303, а с обработкой - 4-5%.Таким образом, предлагаемый способ позволяет существенно повысить 25 точность определения многих нейтральных липидов методом хроматографии в сыворотке или плазме крови: погрешность определения эфиров холестерина в примере 1 снижается," более чем 100 до 4-6%, погрешность определения ацилглицерина в примере 2 снижается с 10-12 до 5-6 Х, погрешность определения холестерина и ацилглицерина в примере 3 снижается с более чем 100до 3-5%, ациглицерина в том же примере - с 25-30 до 4-5 . Способ можетбыть применен для повьппения точностианализа любого биологического материала при использовании подходящих дляэтой цели ферментов. 1. Способ определения липидов всыворотке или плазме крови путем экстракции липидов органическим растворителем с последующей жидкостной хроматографией, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью поньппения точностиспособа, при определении липидов исследуемого. класса проводят предварительный гидролиз балластных липидовв пробе.2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью определения глицеридов, пробу обрабатываютсмесью фосфолипаз.3. Способ по и,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью определения эфирон хслестерина и стероидов,пробу обрабать:нают липазой,4. Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью определения фосфолипидов, пробу обрабатывают холестеринэстеразой.