Способ иммунологического определения одновалентных аналитов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 994 77 55 601 МЗ ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ К ПАТЕ(32) 01.09.89 гирует с зой анал бретен использу или в изОбра делять и киро вку. ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(54) СПОСОБ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОДНОВАЛЕНТНЫХ АНАЛИТОВ(57) Использование. для обнаружения одновалентных аналитов иммунологическим методом, Цель; повышение специфичности Изобретение относится к способу обнаружения аналитов с помощью иммунологического метода.Целью изобретения является повышение специфичности определения путем подготовки рецептора с повышенной специфичностью.Неожиданно путем применения смесимоноклональных антител, из которых каждое не удовлетворяет требованиям специфичности и сродства, удалось получить тест-систему, специфичность которой улучшена по сравнению с индивидуальными веществами.Для иммунологического способа, известного (конкурентоспособного) обнаружения имеется множество вариантов, которые общеизвестны, Как правило, для моновалентных аналитов, в особенности гаптенов, предпочтительны два тест-принципа: либо 10 ецептор, который связан с твердой фазой,реагирует с пробой и маркированным аналитом, либо маркированный рецептор реаопределения. Сущность изобретения: для обнаружения аналитов с помощью иммунологического способа используют смесь не менее двух способных специфически связываться с аналитом моноклональных антител, перекрестная реакционноспособность которых различна при соотношении антител 0,1 - 10:1 и трехкратном количестве МКА по отношению к аналиту, Положительный эффект: применение смеси моноклональных антител иэ которых каждое не удовлетворяет требованиям специфичности и средства, обеспечивается получение тест системы, специфичность которой улучшена по сравнению с индивидуальными веществами, 2 з.п. ф-лы. пробой и связанным с твердой фаитом. В случае относящегося к иэоию, как правило, антитело ется в зквимолярном количестве бытке.зовавшиеся комплексы можно р известным образом оценивать м В зависимости от соответствующего способа, предлагаемая согласно изобретению смесь антител может использоваться в качестве маркированного рецептора, связанного с твердой фазой рецептора, агглютинирующего рецептора и т.д. Для используемой согласно изобретению смеси антител выбираются моноклональные антитела, сродство которых находится в оптимальной области и которые обладают немногими перекрестными реакциями, причем перекрестная реакционноспособность лежит выше заданного значения. Перекрестные реакционные способности используемых для смеси антител различны, т.е, 1799471Аантитела реагируют с различными, подо- в большом количестве. Соотношение отбными обнаруживаемому веществу соеди- - дельных антител выбирается в зависимости. нениями. Т.е, антитело вступает в от данных условий. Предпочтительно исперекрестные реакции с веществами, с ко- пользуют смесь двух антител, соотношениеторыми другие. антитела доказуемо не реа между которыми составляет 0,1 - 10;1.гируют или практически не реагируют (и . Путем смешения по меньшей мере двухнаоборот). Перекрестная реакционноспо- антител, которые вступают с различнымисобйость антитела к определенному веще- соединениями в мешающие побочные реакству при этом не является никакой ции, в"целом снижается перекрестная реакабсолютной, а является относительной ве- "0 ционноспособность. Это снижение, какличиной измерения, которая:зависит от со-правило, при этом превышает эффект разответствующей тест-системы; Репером бавления, так что очевидно имеется синеточкой отсчета) является определяемый ргетическоеповышениедействия,аналит, с которым специфически связано . Предлагаемый в изобретении способантитело. Измерительный сигнал, который.15 позволяет использовать моноклональныедостигается при реакции с аналитом, уста-, . антитела, которые не идеальны,в отношенавливается вплоть до 1007 ь. В отсутствии нии специфичности. Скрининг таких, толькоили в присутствии аналита задаЮтся различ-:частично пригодных для теста антител; меные концентрации перекрестно реагирую-: нее рисковай и поэтомудешевле и быстрее,щих веществ для тест-раствора; С 20 Благодаря применению смеси двух или боперекрестно реагйрующим веществом за-" . лее. моноклональных антител, из которыхтем получается измерительный сигнал, ко-каждое. непригодно для теста само по себетарый соответствует определенномупо отдельности, можно иметь достаточноколичеству собственно аналита, Отсчет идет специфическиетест-Системы, так как благо-.в области самой высокол прецезионности 25 даря смешению нескольких антител с разкалибровочйой кривой; .Этотсигнал также:, личной -.перекрестнойвыражается в процентах. Перекрестная ре- . реакционноспособностью в целом можетакция, например, 10 обозначает, что нуж- .иметься в распоряжении сйстема, котораяно использовать 10-кратное количество . удовлетворяет требованиям.перекрестно реагирующего вещества, что Изобретейие поясняется следующимибы достичь такого же измерительного сигна- . примерамила, как и с помощью однократногоП ри м е р 1. Определение концентраколичества аналита, В другой тест-системе ции стероида в растворах.для перекрестно реагирующего веществаДля обнаружения стероидов в буфереможйо определить другое значение; Требу или жидкостях организма (сыворотка, плаземые втесте перекрестные реакции(задан- . ма, моча и т,д,), используют ферментныйные . значейия) зависят от тест по следующему конкурентному принконцентрационного соотношения соответ- ципу:ствующего перекрестно реагирующего ве-. Материалы; трубка пробирка) Е игап безщества к." аналиту и поэтому могут быть .40 покрытия, стрептавидин; альбумин сывоочень различны;...:ротки крупного рогатого. скота (ЯЯА); рас-.Для изобретения можно применять.мо-.:"творсубстрата: (100 м мол ь/лноклональные антитела, перекрестная ре- : фосфат-цитратного буфера, рН 4,4, 3,2акционноспособность.:которых . ммоль/л. пербората натрия, 1,9 ммоль/лотносительно вещества составляет до трех АВТЯ/ диаммониевая соль, 2,2 -азино-ди кратного, предйочтительно вплоть"до двух- .: . /3-этйл-бензтиазолинсульфокислоты (6)/;кратного верхнего заданного значения,: буфердля- покрытия, 200. ммоль/л натрийЗаданная область лежит. между (пределом) карбонатного буфера, рН 9,6; буфер для разграницей обнаруйения и принимаемой во : бавления: 50 ммоль/л натрийфосфатноговнимание для соответствующего теста гра буфера, рН 6,8; 0,3 ВЯА; промывной расйицей погрешности, Согласно изобрете- : "твор:0,9 ф/ МаС,нию, используют смесь по меньшей мере. - . Бйотинилирование МАКЯ осуществля"двухмоноклональных антител. Также мож- ", ется согласноАСЯ 100/(1978) 3585-3590 сно Смешивать более, чем 2 видов монокло- "биотийом путем взаимодействия с й-оксинальных антител, Соотношение, в котором 55 сукцйнимидбиотином в соотношении 10:1.находятся ийдивидуальные моноклональ-:" (Трубки) пробирки с препаратом очи, ные антитела в смеси, выбирается в зависй-"щенного раствора антитела 10 мкг/мл) вмости от их сродства и специфичности. Как покрывном буФере(0,2 моль/л карбонат) бийрааило,антителосминимальной перекре- карбонат натрия, рН 9,6 инкубируют пристной реакционной способностью имеется комнатной температуре в течение 1 ч. Происходит спонтанное связывание этого антитела со стенкой пробирки. Пробирки затем дополнительно обрабатывают с помощью 50 ммоль/л фосфатного буфера 0,30 альбу- мина в течение 15 мин и промывают.Специфические. антитела добавляют в буфер для разбавления и инкубируют в течение 60 мин, Затем добавляют 600 мкл пробы (аналит, перекрестно реагирующие вещества и т.д.) й 500 мкл коньюгата фермента (Эстриол-РОД, РОД - активность; 200 гпО/мл) и инкубируют 60 мин. Для того, чтобы дополнительно исследовать перекрестную реакцию к другим стероидам, добавляют к раствору пробы различные количества испытуемого Стероида. Понижение измерительного сигнала за счет других :стероидов обозначает перекрестную реак- цию, высота которой на стандартной кривой может отсчитываться с помощью подлинного аналита. После дальнейшей стадии промывки . определяетсяактйвность пероксидазы путем добавкй раствора субстрата, для проявления красителя (1 000 мкл) предварительно осуществляют- дальней; шую инкубацию (ЗО мин) Измерение окрашенной смеси осуществляется при 422 нм на фотометре.Пробирки с раствором стрептавидина инкубируют в течение 1 ч (при комнатной . температуре в покрывалом буфере и допол: нительно обрабатывают с йомощью 50 , ммоль/л фосфатного буфера, 0,3% альбумина в. течение 15 мин и промывают.Специфические антитела добавляют в буфер для разбавления и инкубируют в течение 60 мин. Затем добавляют 600 мкл . пробы (аналит, перекрестно реагирующее : вещество и т,д,) и 500 мкл коньюгата фер. мейта (Эстриол-РОД, РОД - активность: 200 - мИмл и инкубируют в течение 60. минут. ,Для того, чтобы дополнительно исследовать перекрестную реакцию к другим стероидам, к раствору пробы добавляют различные количества йспытуемого стероида, Снижение измерительного сигнала за счет других стероидов означает перекрестную реакцию, высота которой может отсчитываться на стандартной кривой с подлинным аналитам. После дальнейшей стадии промывки "определяется активность пероксидазы путем добавки раствора субстрата; для проявления красителя (1000 мкл) осуществляют предварительно. дальнейшую инкубацию (60 минут), Измерение" окрашенной смеси осуществляютпри 422 нм в фотометре,П р и м е р 2, Определение перекрест.ных реакций для смесей МЛК (Экстриол.19,6,9 и МАК Экстриол.1,26.18Материалы.-/ЕЗ РОД-коньюгат/ЕЗ-РОД-Конъюгатготовят так, что экстриол активируют в 6-положении с помощью неполного сукцината изатем этерифицируют сукцинимидом, Пол 5 ученный сложный эфир сочетают непосредственно с пероксидазой (500 и 100 гпО РОД- активность/мл - МАК (ЕЗ) 19,6.9(ЕСАСС 89082503) биотинилируют (100мкг/мл)10 - МАК (ЕЗ) 1.26,18 (ЕСАСС 89082502)биотинилируют (1000 мкг/мл). Концентра-.ции используемых, перекрестно реагирую-.щих веществ: Эстриол (ЕЗ): О, 5, 10, 20, 40нг/мл) в тесте 1:5 разбавление/Экстрадиол15 (Е 2): 10, 100 нг/мл, Эстетрол (Е 4): 10, 100нг/мл. ЕЗ-сульфат; 50, 100 нг/мл ЕЗглюкуронид: 50, 100 нг/млОсуществление определения происходит согласно примеру 1 б,20Результаты показывают, что МАК 19,6,9сильно перекрестно реагирует с эстрадио-лом и зстетролом, в то время как МАК1,26.18 сильно перекрестно реагирует с эс 25 триол-сульфатом и эстриол-глюкуронидом, Антитела используют в различныхсоотношениях в смеси. При различных соотношениях компонентов в смеси изменяютсясоответствующие перекрестные реакции,30 Получается более оптимальная и болеепредпочтительная область,П р и м е р 3. Определение перекрестных реакций для смесей МАК эстриол 19,6,9и МАК зстриол 9 В 4.С 2,35 Осуществление определения происходит аналогично примеру 1 а. МАК 9 В 4,С 2(Изготовитель 1 Р 1, 1 щегрЬагпч 1 аЬога 1 ог 1 ез1 лб, Ке 99 Ъопа 76110, Израиль) реагируетаналогично 1;26.18 сильно перекрестнос40 . ЕЗ-сульфатом и ЕЗ-З-глюкуронидом.Также здесь получается МАК-концентрация, при которой ХВ отчетливо снижена,П р и м е р 4, Определение перекрестных реакций для смесей МАКтестостерон,45 8.15,1 и МАК тестостерон 700-03Материалы:- непокрытые пробирки 7 игегп-поликлональные овечьи антитела (196)противмышиного Гс ф О мкг/мл; для покры 50 тия пробирки)- Кротеин СТестостерон РОД - коньюгат (тестостерон-РОД - коньюгат готовят так,что тестостерон активируют в 3-положении с55 помощью карбоксиметилоксина и этерифицируют сукцинимидом. Полученный сложный эфир сочетают прямо с РОД/РОД -активность 100 гп 1 (мл),Тестостерон1799471 4-андростен,17-дион = андростендион 2, Способ по и.1, от лича ю щи йс я тем, что используют смесь двух моноклональных антител в соотношении 0,1 - 10;1,3, Способ по пп, 1 или 2, о т л и ч а ющ и й с я тем, что используют трехкратно количество маноклональных антител по отношению к аналиту с перекрестной реакционнослособн остью к одному или нескольким веществам,Составитель В. БрусиковскаяТех ред М.Моргентал Корректор С. Юско Редактор Заказ 793 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101 11-кето-тестостеронМАКтестостерон 8,15,1 (ЕСАСС89082501) 5Мак,тестостерон 700-03 (изготовитель:Меб 1 х В 1 отесЬ 1 псГогз 1 ег С 11 у, СА 94404, США: Вегт - 1 ч.Т-03).Концентрация используемых перекрестно реагирующих веществ:тестостерон: О. 1,25, 2,5. 5, 10, 20, 40нг/мландростендион: 2,5, 5, 10. 20, 40, 80, 160.320, 640 нг/мл 1511-кето-тестостерон; 2,5, 5, 10, 20. 40,80. 160, 320, 640 нг/млопределение осуществляют аналогичнопримеру 1 а,Результат: 20МАК 8,15,1 и МАК 700-03 являются специфическими антителами против тестостерона.однако. показывают относительно высокийХй к андростендиону. соответственно, 11 кето-тестостерону. 25Неприсовдиненные антитела используются в различных соотношениях в смеси.П р и м е р, 5. Определение перекрестной реакции дя смесей МАК фенобарбитал2,341.115 и МАК фенобарбитал 2,93,37 30Материалы:трубы дурана без покрытия,поликлональное антитело овцы (190)против мыши - Гсу (г/мл)для. нанесения покрытия на трубы), 35. кротеин С,коньюгат фенобарбитала-РОД (коньюгат фенобарбитала-РОД получают в результате того, что производят активированиечерез й в 1-положении бутиратом и этерификацию посредством сукцинимида. Образованный сложный эфир связываютнепосредственно с РОД (активность РОД100 милли-единиц/мл),фенобарбитал, 45секобарбитал,амобарбитал,пентобарбитал;примидон,МАКфенобарбитал 2.341.115 (ЕСАСС 5090071903),МАК фенобарбитал 2.93.37 (ЕСАСС 90071904).Концентрация введенных перекрестно реагирующих веществ:фенобарбитал: О, 7,8, 15.6, 31.3, 62.5, 125 нг/млсекобарбитал: 0.2, 1,иг/мл,амобарбитал: 0,2, 1 /гг/млпентобарбитал: 0,2, 1 р г/млпримидон: 1,5 р н/мл.Определение производят аналогично примеру 1 а.Результат:МАК 2.341, 115 и МАК 2,93.37 представляют специфические антитела относительно фенобарбитала, но показывают сравнительно высокие перекрестные реакции, во-первых, к примидону (МАК 2,341,115), во-вторых, к секобарбиталу. амобарбиталу и пентобарбиталу (МАК 2.93.37),Антитела применяют в различных соотношениях между частями смеси.На перекрестную реакцию МАК-смеси относительно фенобартитала может оказывать влияние смешивание. И здесь может применяться соотношение между частями смеси, при котором все перекрестные реакции лежат ниже ожидаемых величин,Формула изобретения 1. Способ иммунологического определения одновалентных аналитов путем конкурентного связывания определяемого аналита с определенным количеством мар. кированного или иммобилиэованного моноклонального антитела. о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения специфичности, используют смесь не менее двух моноклональных антител, специфически способных связываться с аналитом, перекрестная реакционноспособность которых различна.