Способ проведения иммуноанализа

)5 Г 01 И 33/58 ОБ ТЕЛЬСТВУ Н АВТОРСКОМУ СПОСОБ ПРОВГЦВНИ ОАНАЛИЗА ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТПРИ ГКНТ СССР(71) Институт биохимии им,А.Н.БахаАН СССР, Московский институт тонкойхимической технологии имЛ,В,Ломоносова, Государственный институт стандартизации и контроля лекарственныхи бактерийных препаратов им.Л.А,Тарсевича и Всесоюзный научно-исследовательский институт биологическогоприборостроения(56) Авторское свидетельство СССРк, кл. С 01 И 33/54, 1988,Изобретение относится к биохимии,в частности к способам проведения иммуноанализа.Целью изобретения является повышение чувствительности способаУказанная цель достигается тем,что в качестве люминесцирующих .металлопорфиринов используют металлопорфирины, обладающие свойством замедленной флуоресценции; при этом возбуждение светом проводят в длинноволновой полосе поглощения металлопорфиринов, а измерение уровня замедленной флуоресценции связавшегося металлопорфирина ведут в диапазоне длинволн максимума флуоресценции.(57) Изобретение относится к биохимии, в частности к способам проведения иммуноанализа, Цель изобретения -увеличение чувствительности способа.Это достигается за счет того, чтоиспользуются металлопорфирины, способные при ковалентном мечении белковрезко увеличивать уровень замедленной флуоресценции, спектрально совпадающей с обычной флуоресценцией.Это дает возможность, возбуждая флуоресценцию металлопорфиринов в длинноволновой полосе поглощения и регистрируя свечение в той же спектральнойобласти, минимизировать фоновое влияние фосфоресцирующих примесей, присутствующих в анализируемом образцеи в материале кюветы. 1 табл. П р и м е р 1, Исследуемую пробу с диагностируемым объектом - клет ками А 1 са 18 епцз Гаеса 11 з в концентрации 1 млн,микробных тел/мл обрабатывают гомологичными антителами к А 1 са 18 епцз Гаеса 11 з, приготовленными из сыворотки крови кролика. Антитела., мечены А 1(ОН)-копропорфирином в соотношении белок/порфирин 1/1 (М). Параллельно проводят обработку исследуемой пробы гетерологичными антителами, меченными А 1(ОП)- копропорфирином, Обработку проводят добавлением в пробирки с пробой по 1 мл гомологичных игетерологичных антител в концентрации 1 мкг/мл, Опытную и1561042 кой - 350 отц,ед, Числовое соотношение опыт/контроль 1300/350 равко 3,7,П р и м е р 2. В лунки полисти 5рольного микропланшета для иммунойерментного анализа (Пупайес 1 д, США)адсорбируют антитела к определяемомуантигецу; заливают в кадддую лункупо 0,2 мл актител (10 мкг/мл в 0,1 Икарбокатном буйере, рН 9,1), инкубио оруют 1 ч при 37 С и ночь при 4 С,Затем раствор сливают и промываютлунки буфером ФСБТ (Физраствор, рН7,4, содержащий 0,1 Е тритона Х).Заливают в 2 ряда лунок (опыт иконтроль) по 0,2 мл стандартных раст воров антигена из Ряец 1 опопая ацгор.поза (1; 0,5; 0,25; 0,12; 0,06;О мкг/мл) и инкубируют при 37 С в течение 1 ч, Затем сливают растворы,промывают лунки 3 раза ФСБТ, заливают во нсе лунки 1 ряда антитела, меченньде А 1(ОН)-копропорйирином(20 мкг/мл в ФСБТ), а в лунки второго25 ряда - антитела, меченные Рсд-копропорйирином (20 мкг/мл). После 1-часовой инкубации при 37 С растворысливают, промывают лунки ФСБТ, заливают по 0,2 мл десорбирующего раствора (3 мМ ЦТАБ), Затем добавляютв лунки кислородсвязывающий агентсульйит натрия (5 мг/мл), переносятрастворы н измерительные кюветы на0,5 мл и регистрируют замедленнуюФлуоресценцию А 1(ОН)-копропорфирика ифосфоресценцию Рй-копропорфирина нусловиях, описанных дд примере.1. Результаты приведены в таблице. Чувствительность способа - 0,12 мкг/мл,. вьппе, чем чудствительность способапрототипа (0,25 кг/мл),т Г0,5 0,25 0,12 Концентрацдя ацтигеца 1 г 0,06 0 Сигнал: Прецлагаемый способ Прототип8502000 300 110 50 800 600 450 35 30400 400 Формула изобретенияСпособ проведения иммуноанализа шутем получения аддвгител или антиге.цов, меченных люмицесцирующими соединениями, проведения иммунохимической реакции и детекцид специЬического Связывания по люминесценции меченого Соедидендя, о т л и ч а ю щ и й с я дем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестне люминесцируюших соединений используют контрольную пробирки затем освобожцад 0 т от неснязавшихся меченых антителцентрифугдровакием при 5000 об/мин втечение 5 мин. Надосадок сливают,а осадок промывают изотоническим раствором, повторяя операцию центриФугирования, и ресуспендируют в изотоническом растворе хлорида натрия. Затемдополнительно н раствор вводят кислородсвяэьдвающий реагент всульфитнатрия в концентрации 3 мг/мл.нПараллельно проводят акалогичныиэсперимент, в котором используютгомологичные и гетерологичные антитела, меченные РЙ (2+)-копропорфиринбм (прототип).Регистрацию уровня сигнала опытндй и контрольной проб осуществляютн спектройлуориметре 1.8-5 йирмыРегЕдп Е 1 иег, Временная задержкамежду актом возбуждения и приемомизлучения - 1 мс,а) Режим измерения замедленМойддуоресценции А 1(ОН) -копропорйирина:длина волны возбуждения 570 нм (длинноволновая полоса поглощения); регстрация при длине волны 578 нм.Превьппение сигнала опытной пробы(40 отн.ед.) в 9,5 раз свидетельствует о наличии определяемого микроорганизма в пробе,б) Регистрацию йосйоресценции Р 1 (2+)-копропорйирина (прототип) при длине волны 670 нм осуществляют при возбуждении светом с длиной волны 395 нм (полоса Сорэ). Сигнал опытой пробы 1300 отн,ед., контроль 1металлопорфирицы, обладаюцде свойстВом замедленной ЬлуОресцецции нозбуждение светом проводят в цлинцоволновой 06 -полосе поглощения металлопорфирина, а измерение уронця замедленной флуоресцецции ведут н диапазоне длин волн флудресцеддции металлопорфирина, при этом задержка междувозбуждением и измерением уровня замедленной Ьлуоресцецции эквивалентнавремени ее затухания.