Способ определения т лимфоцитов человека

(57) Изобр чегов фосфатдо 207-ной ъем 57.-ных ур смешисут, посл ы отмывают вь доводяттем один о итроцитов течение э роциты трижд буЬере и вно концентрации, 3 фиксированных э г этапалимфотим вают с тремя мальн ого С(18 С) сь рации 80 рацией на вс тряхив а цит вор о мг/м сефа ют и 45 С яют следую Способ осущест бразом,207-ную взвесь осфатным буфером ают с 7,27.-ным р ида рН,2 в рав нкубируют при коно ытых смешиальдеСмесьрату- . эритроцитоствором ац ых объемах натной тем бане присибилизиротмываютрН,2, с ован 0,97,ер ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИПРИ ГКНТ СССР(71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии иинфекционных болезней и Алма-Атинскийгосударственный институт усовершенствования врачей(56) Могегга 1 Геггагйп М.,Соорег М.Л. - СЬагасйеггаСхоп оГЬцшап Т-се 11 яцЬрорц 1 аС 1 опя ая с 1 еЫпей Ьу яресзЯс гесерсогя акогцпоя 1 оЬц 1 дпая. Хп,: Сопещрогагур 1 сяп 1 влцпо 1 ору, 1978, ч 8, р. ЕДЕЛЕДИЯ Т -ЛИМФОЦИТОВ ние относится к медициИзобретение относится к медицине, в частности к клинической иммунологии.Целью изобретения является повышение чувствительности способа упрощение за счет исключенияпредварительного выделения Т,ЯО 156104 не, в частности к клинической иммунологии, Цель изобретения - повышение чувствительности способа и его упрощение за счет исключения этапа выделения Т-лимйоцитов. У обследуемых людей берут кровь, выделяют лимфоциты и смешивают с эритроцитарным диагностикумом, приготовленным путем сенсибилизации эритроцитов кур с иммуноглобулином человека, Предварительноо диагностикум прогревают при 45 С в течение 1 ч, после чего лимфоциты инкубируют с эритроцитами барана. Наличиев крови обследуемых Тр-лимфоцитов определяют по числу комплексных розеткообразующих клеток, В сравнении с прототипом увеличивается чув- Ж ствительность на 1,67, Упрощение способа достигается за счет исключения этапа предварительного выделения Т- лимфоцитов. объемами раствора норноглобулина класса тки человека в концентл, полученного гельфильтдексе С, рП,8. Смесьпрогревают в водянойв течение 60 мин. Сенные эритроциты трижды -ным раствором ИаС 1, жащим эмбриональную те4 показали высокую чувствительностьи специфичность предлагаемой тестсистемы, Так, титр в РПГА с анти 1 РС-сывороткой превышал разведение1:1280, тогда как с антирИ-сывороткой агглютинация вообще отсутствовала,П р и м е р 2, Специйичность реагирования предлагаемой тест-системыс РсК лимйоцитами проверялось путемвзаимного истощения общего пула лимфоцитов от РсК -положительных клеток. Мононуклеары инкубировали с одной тест-системой 15 мин при 37 С,центрийугировали 5 мин при 1000 об/мини вновь инкубировали 90 мин при 4 С,+затем освобождали от РсК -клетокпутем их седиментации на одноступенчатом градиенте плотности фиколлверографина (1,077 г/смэ), С мононуклеарами, собранными из интерфазы,ставили реакцию ЕА-розеткообразования с известной тест-системой.После истощения общего пула мононуклеаров от РсК -клеток как с помощью известной, так и предлагаемойтест-систем дьполнительные,розеткипрактически не выявлялись (лимфоциты, присоединившие к своей поверхности более 3 эритроцитов, встречалисьв единичных случаях).Разработанный стабилизированныйЕА-реагент выявлял большее количестФво РсК -мононуклеаров, гогда какпосле взаимодействия лимфоцитов сЕА-реагентом известного способа определялось еще некоторое количествоРсКу на клетках при использованииразработанного .ГА-реагента (2,2+0,4 Х, впервой серии опытов - 0,6++0,2 Е, р/0,001),т.е. чувствительностьбыла на 162 выше предлагаемого реагента в сравнении с известным.Следовательно, предлагаемый ЕА-реагент обладал более высокой чувствительностью и специйичностью при идентийикации РсКу на мононуклеарах перийерической крови человека.Кроме того, предлагаемый способпроще в сравнении с прототипом засчет исключения этапа предварительного выделения Т-лимйоцитов,ор мул з обретени Способ определения Т-лимфоцитовчеловека, включающий забор крови,выделение лимйоцитов, инкубацию их 3 1561041 лячью сыворотку в разведении 1:300. 0 мытый эритроцитарный диагностикум ЩА-реагент) консервируют 0,057 в н раствором азида натрия,Лимйоциты, выделенные путем седимЕнтации на одноступенчатом градиенте фйколл-верограйина (плотность 1077 г/мл), доводят до концентрации 2 ф 10 клеток в 1 мл средой У 199. 1 ОО мл клеточной взвеси смешивают со 1О мкл 17-ной взвеси эритроцитарного д агностикума. Смесь инкубируют 1 мин при 37 С с последующим добавл нием 200 мкл 17-ной взвеси нативо15 нфх эритроцитов барана. Далее смесь цфнтрийугируют при 1000 об/мин в те.чение 5 мин и помещают в холодильную кмеру (4-6 С) на 90-120 мин, После окончания инкубации полученный осадок осторожно встряхивают. Подсчет проводят в нативных препаратах под покровн пк стеклом в световом микроскопе ( в, 400 х), За комбинированную розетк принимают лимфоциты йиксироваве на своей поверхности одновременно б лее двух эритроцитов кур и барана.П р и м е р 1. Для проверки спецюйичности и точности полученных ре - зультатов по предлагаемому способу нЭ лимйоцитах доноров была проведена сЮрия опытов для доказательства невОзможности йормирования спонтанных рОзеток лимйоцитов с йиксированными а 1 етальдегидом эритроцитами кур, не нагруженными 1 яС, Результаты опытов показали, что исследуемые эритроциты не йормируют спонтанных розеток с монрнуклеарами периферической крови человека.40Следовательно, при использовании сенсибилизированных 1 яС - человека эритроцитов кур розеткообразование обусловлено взаимодействием Рс-фрагментов иммуноглобулина класса С с соответству рецепторами (РСКГ) 45 лймфоцитов,С целью определения специйичности и чувствительности предлагаемой тест системы для идентификации РсКу лимйоцитов (сенсибилизированные 1 яС зритроциты кур) диагностикум бып испытан в РПГА микрометодом в 96-луночиых планшетах типа Такачи с исполь зованием.моноспецийических антиимму- Ф ноглобулиновых сывороток против 1 ф и 1 яС человека (производства ШП 1 эпидемиологии и микробиологии имЛ.Ф. Гамалеи) . Результаты проверкиСоставитель В,ЛитовченкоТехред М.Дидык Корректор Л.Патай Редактор М,Бандура Тираж 509 Заказ 976 Подписное ВНИИПИ Гасударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 в присутствии эритроцитов баранаи иммуноглобулинового эритроцитарнго диагностикума и по количествукомбинированных розеткообразующихклеток определяют Т-лимАоциты,о т л и ч а в щ и й с я тем, что,./с целью повышения чувствительности1 1561041 6способа и его упрощения за счет исо- ключения. этапа выделения Т-лимфоцитов, в качестве эритроцитарного диагностикума используют эритроциты кур,сенсибилизированные иммуноглобулиномчеловека, и добавляют его перед инкубацией с эритроцитами барана,