Способ получения иммуносорбента

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН Н 9) Ъ.ЭО П 1) А 9/1 К 47/00 11 Аб ЕННЫЙ КОМ 3 ОБРЕТЕНИЙ ГОСУД АРСПО ДЕЛ ЕТ СССРИ ОТКРЫТИЙ САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ТЕЛЬСТВ ВТОРСНО(21) (22) 1 (46) о Октябрьсудового Краский инсти 3600002/28-13204,8315,12,84. Бюл. У 46(71) Ленинградский орденакой Революции и ордена Трного Знамени технологичестут им. Ленсовета(54)(57) 1. спосоБ получения иииуно- СОРБЕНТА для выделения противогрнппозных антител путем модификации носителя с последующей сорбцией анти- . гена - вируса гриппа, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения сорбционной емкости по антигену, в качестве носителя используют макропористое стекло, которое подвергают модификации обработкой. парами винилтрихлорсилана в токе инертного газа при 170-180 С и гидролизояополученного продукта парами воды.2. Способпоп, 1, отличающ и й с я тем, что обработку парами винилтрихлорсилана ведут в течение 20-30 мин,1128Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к имуннохимии, и может быть использовано для выделения чистых специфических антител методом аффинной хроматографииПри иммобилизации антигена - ви.руса гриппа на нерастворимом носителе образуется специфический иммуносорбент, который должен обладатьЪследующими свойствами: способностью 10 адсорбировать антитела из смеси компонентов, освобождать адсорбированные антитела из комплекса со спе- цифическим сорбентом количественно при высокой степени их очистки от 15 сопутствующих аллергенов, обладать высокой сорбционной емкостью по специфическим антителам, обладать подходящими механическими свойствами, позволяющими фильтровать и наполнять колонки, быть нечувствительным к микробному воздействию.и к изменениям рН.Известен способ получения иммуносорбентов для выделения антител, за ключающийся в обработке полисахаридного носителя: целлюлозы, сефадекеса, сефарозы, производных целлюлозы -2- амико,6-дихлор-симм-триазином, раствором карбоната натрия и соляной кислоты с последующей промывкой водно-ацетоновой смесью и О, 1 М Фосфатным буфером и связыванием антигена за счет реакции с аминогруппой 1 .35Недостатками известного способа являются сложность и длительность получения иммуносорбента, а также использование в качестве матрицы органических носителей, которые механически непрочны, подвергаются дей ствию микроорганизмов, обладают структурной лабильностью, чувстви-тельны к изменениям рН. Известен способ получения иммуно сорбентов путем взаимодействия неорганической матрицы и пористого стекла с-аминопропилтриэтоксисиланом, заключающийся во взаимодействии очищенного путем нагревания в течение 3 ч в О, 1 М НМО , высушенного при 90 С и нагретого до 700 С в теО3 фчение 3 ч в присутствии кислорода, стекла с 10 Ж-ным раствором-аминопропилтриэтоксисиланом в метило вом спирте или толуоле, в последующем превращении алкиламино-силан- стекла в ариламинопроизводные с по 956 2 мощью реакции с Н-нитробензоилхлоридом, восстановлении нитрогрупп 0 а,5 О,и взаимодействии с антигеном 2,Недостатками данного способа являются сложность и длительность получения иммуносорбента, необходимостьдополнительной активации после процесса силанизации поверхности стекла, применение органических растворителей: метилового спирта, толуола.Наиболее близким к предлагаемомупо достигаемому результату являетсяспособ получения иммуносорбента длявыделения противогриппозных антител путем модификации носителя с последующей сорбцией антигена - вирусагриппа, заключающийся в следующем:носитель агарозу активируют бромцианом и затем проводят сорбцию.антигена 3 .Недостатками способа являютсянизкая сорбционная емкость иммуносорбента по антигену 37-397, низкийвыход антител при десорбции 1 М иЗМа 3 - 22-237 при их низкой удельной активности, т.е . очистке 0,270,45 (удельная активность - это отношение титра выделенных антител.к концентрации белка). Возможностьувеличения выхода антител за счетпредварительной обработки кислымибуферными растворами приводит к усложнению технологии выделения антител, при этом наблюдается значительное количество сопутствующего выделенным антителам белка, т.е. низкая степень очистки т удельная активность. 0,45,Цель изобретения - повышениесорбционной емкости по антигену,Поставленная цель достигается тем,что согласно способу .получения иммуносорбента для выделения противогриппозных антител путем модификацииносителя с последующей сорбцией антигена - вируса гриппа, в качественосителя используют макропористое стекло, которое подвергают модификации обработкой парами винилтрихлорсилана в токе инертного газа при 170-180 С и гидролизом полученного.Опродукта парами воды. Обычно обработку парами винилтрихлорсилана ведут 20-30 мин,Способ осуществляют следующим образом.Макропористое стекло обрабатывают в токе инертного газа парами винил3 11289трихл рсилана на 20-30 мин при 170180 С в реакторе проточного типа со,последующим удалением непрореагировавшего винилтрихлорсилана и образовавшегося хлористого водорода, а затемгидролизом хлор-иона, входящего в состав продукта, парами воды и обработкой вирусом гриппа.Иммобилизацию вируса проводят путем взаимодействия сорбента с противогриппозной вакциной. Лдсорбциюантител проводят из иммунной сыворотки в статических условиях бач-методомна электромеханической мешалке соскоростью вращения .11 об/мин в объеме сыворотки 2 мл при 25 С и времениоконтакта 30 мин трижды. Отмывку антител проводят О, 1 М Фосфатным буферомрН 7,2 с 0,15 М 8 аС 1 порциями по 10 мпв течение 15 мин до полного удаления антител в отбираемых фракциях.Титр антител определяют в реакцииторможения гемагглютинации (РТГА).Десорбцию антител проводят трис+НС 3рН 9 и 1 М и ЗМ КаЛ буферными 25растворами порциями по 10 мл в течение 15 мин до полного удаления антител в отбираемых фракциях.В результате обработки образуетсяиммуносорбент, устойчивый в интерва- З 0ле рН 2,0-9,0.Вируссодержащий сорбент стабилен и может повторно ис-пользоваться в широких пределахдиссоциации без заметной потери способности связывать антитела,35Количество винильных групп в поверхностном модифицированном слоесорбента О, 12-0, 14 мг-экв/г. Количество химически адсорбированного антигена - вируса гриппа - 15260 ГАЕ/г40сорбента (ГАЕ-произведение обратноготитра на объем пробы), что составляет627 от общего количества антигена.Были проведены опыты по проверкеспецифичности пблученного иммуносор 5, бента, В опытах использовали штамм ви-руса гриппа А(НН ). Для этогоиспользовали иммунную сыворотку квирусу Х(Н й,). Биологическуюактивность антител определяли по реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)50с использованием микротитратора Така"чи,Полученные результаты показали,что на данном иммуносорбенте неспецифические антитела не сорбировались,т.е. наблюдалась только биоспецифическая сорбция антител,Выбранный интервал температур 170180 С обработки носителя парами виО 56 4нилтрихлорсилана обусловлен тем,что при этой температуре поверхностьстекла наиболее гидроксилированаУвеличение температуры приводит кдегидратации ОН-групп на поверхности,а слецовательно, к снижению количества вступивших в реакцию РТХС групп,т.е. уменьшению модификатора в поверхностном слое и снижению активности.Уменьшение температуры обработкиприводит к замедлению взаимодействияВТХС с гидроксильными группами, а также не исключает возможности присутствия молекулярно-связанной воды, которая при взаимодействии с ВХТС может привести к частичному нековалентному связыванию модификатора с поверхностью носителя, т,е. к снижениюустойчивости сорбента. Выбранное время обработки носителя парами ВТХС20-30 мин обусловлено тем, что 20 минэто то время, при,.котором все гидроксильные группы поверхности вступаютво взаимодействие с парами ВТХС . Увеличение времени обработки выше 30 миннецелесообразно, так как поступающие пары, не реагируя, выводятсяиз реактора. Уменьшение времени контакта снижает количество модификатора в поверхностном слое, что снижает количество активных центров,снижает емкость сорбента по антигену - вирусу гриппа,П р и м е р 1, Навеск пористого стекла 1 г размером 2000 А и удельной поверхностью 25 м /г помещают в реактор проточного типа и в токе сухого инертного газа обрабатывают парами винилтрихлорсилана (ВТХС) при 170 С 20 мин с последующим удалеонием непрореагировавшего ВТХС и образовавшегося НС, затем проводят гидролиз хлор-иона, входящего в состав продукта, парами воды и далее проводят сорбцию вируса гриппа в объеме 2 мл противогриппозной вакцины в течение 1 ч при 25 С, полученный иммуносорбент промывают фосфатным буфером рН 7,2,Удаление непрореагировавшего ВТХС и образовавшегося НС 8, а также гидро- лиз хлор-иона контролируют по покраснению индикаторной бумажки, смоченной метилоранжем. Конец - отсутствие покраснения. Примерное время удаления 3-5 мин, гидролиз 5-7 мин. Количество винильных групп на сорбенте6 1128956 Удельная активность антител Количество снятыхантител с иммуносорбента, 7. 37-39 Агароза + ВС + вирус грипп прототип трис+НС 22 Обработ буфером трис+НС 50Ми ЗМ а 3 кисл снят МНа О, 12 мг-экв/г. Емкость сорбента по вирусу гриппа штамм А(Н 1 ф ) 15264 ГАЕ/г сорбента, что составляет 62, 17. Затем навеску сорбента 0,5 г с иммобилизованным вирусом гриппа по мещают в объем 2 мл иммунной сыворотки и проводят адсорбцию антител до полного насьпцения сорбента - 3 раза по 30 мин при 25 С, отмывают фоновымобуфером и проводят десорбцию по опи санной методике. В качестве элюирующих растворов используют трис+НС 1 .рН 90 с 1 М и ЗМ И а 3Количество десорбированных (выделенных) антител составляет 503. Количество белка, 15 сопутствующего снятым антителам, 2.,0 мкг/мл, общий титр снятых антител 1:80. Удельная активность выделенных антител 40.П .р и м е р 2. То же, что в при мере 1, но навеску стекла обрабатывают парами ВТХС при 170 оС 30 мин., Емкость сорбента по вирусу гриппа - 1 антигену - 15258 ГАЕ/г сорбента, что составляет 623. 25Количество десорбированных антител 47,83. Количество белка, сопутствующего выделенным антителам, 1,9,мкг/мл. Общий титр снятых антител 1:62. Удельная активность анти- ЗО тел 32,6П р и м е р 3. То же, что в примере 1 но навеску стекла обрабатыУовают парами ВТХС при 180 С. 20 мин. Емкость сорбента по антигену 15289 ГАЕ/г аорбента, что составляет 62,27. Колйчество десорбированных антител 51,5 Х. Общий титр снятых антител 1:88. Количество белка, сопутствующего антителам, 2, 17. Удельная активность антител 4 1,9.Данные по сравнению полученных ре" зультатов с прототипом, а также с контролем, где был взят сорбент, модифицированный группами без иммобилизованного вируса гриппа, представлены в таблице.1 Как видно из таблицы, количество адсорбированного антигена - вируса гриппа в 1,6 раза вьппе, чем в прототипе, при зтом количество снятых антител в 2,2 раза вьппе, чем в.прототипе, в случае выделения антител без дополнительной обработки сорбента с комплексом антиген-антитело. Степень очистки выделяемых антител от сопутствующего белка в 93-120 раз вьппе, чем в прототипе, независимо от способа элюцииантител с поверхности иммуносорбента.Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет приго. - товить иммуносорбент на основе пористого стекла, содержащий в поверхностном слое винилсодержащие группы и антиген - вирус гриппа.; Этот сорбент получается по упрощенной технологии,. не требует затрат большого количества времени и вредных ядовитых реактивов, химически устойчив, дешев, долговечен и, главное,обладает высокой сорбционной емкостью по антигену - вирусу гриппа, что позволяет повысить выход чистых антител в 2,2 раза при увеличении степени из очистки от белка в 90-120 раз.1128956 Продолжение таблицы 1 ) д Винилсодержащеепористое стекло +иммобилизованныйвирус гриппа 41,9 51,5 62,1 Ви нилс одержаще е пористое стекло без иммобилизованного вирусагриппа Заказ 9269/6 Тираж 687 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж Рауушская наб д. 4/5.Филиал ППП"Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Составитель О.СкородумоваРедактор Н.Горват Техред АБабинец Корректор И МУ