Способ получения аденозинтрифосфатазы

СОЮЗ СОВЕТСНИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСН СПУ БЛИК 19) 04 С 12 К 9/00 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН упротазукласба,хонов ГОСУДАРСТВКННЫИ НОНИТЕТ СПО ДЕЛАН ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Всесоюзный ордена ТрудовогоКрасного Знамени научно-исследовательский противочумный институт(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТАЗЫ с помощью высаливаниясульфатом аммония, центрифугирования и гель-фильтрации, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельющения способа, аденозинтрифосфавыделяют из холерного вибрионаснческого биовара, серовара Инавтамм 569 В с инактивированием0,13-ным мертиолатом, центрифугированием культуры при 4000-6000 8 втечение 25-30 мин, высаливаниемсульфатом аммония при 903 насыщения,отделением осадка через 16-18 ч центрифугированием при 4000-ЬООО е в течение 15"20 мин, гель-фракцией растворенного в дистиллированной водеосадка на акрилексе Ри гель-хроматографией на биогеле АМ с последующей элюцией теис -буферомрН 7,5-8,0.Изобретение относится к медицине,а именно к микробиологии.Цель изобретения - упрощение способа эа счет использования клеточногоаутолиза, 5Способ осуществляют следующимобразом,Для получения аденоэинтрифосфатазы (АТФ-азы) используют холерный вибрион классического биовара, серовараИнаба, штамм 569 В.Выращивают холерные вибрионы вреакторе-ферментере, затем инактивируют культуру 0,17.-ным мертиолатом.В присутствии мертиолата происходит 15аутолиз (разрушение клеток вибрионов), в результате чего АТФ-аза выходит иэ клеточных мембран в культуральную жидкость, которая в дальнейшем служит источником фермента. гоПосле аутолиза реакторную культуруцентрифугируют для отделения ферментов разрушенных клетокпри 4000-6000 дв течение 25-30 мин и иэ надосадка,Через 16-18 ч сформировавшийсяпри высаливании осадок отделяют центрифугированием при 4000-6000 е в течение 15-20 мин, растворяют дистиллированной водой и обессоливают наколонке с акрилексом Р, элюируяферментсодержащий белок 0,005 Мтеис -НС 1 буфером рН 7,6-7,8.Обессоленный препарат, содержащий АТФ-аэу, гель-хроматографируютна колонке с биогелем АМ. Злюцию проводят 0,005 М трис -НС 1 буфером рН 7,5-8,0,Все операции по выделению и очистке фермента проводят под контролемопределения удельной активности, 40Степень очистки АТФ-азы составляет41,83 крат. Выход препарата фермента1,5-27.П р и м е р, Культуру г 1.Ьгьо сйо 1 егае 569 В выращивают в течение 8- 510 ч в 250 л реакторе-ферментере вусловиях аэрации при 34-36 С глубинным методом на бульоне из ферментированного гидролизата казеина рН 8,0,содержащего, 7.: пептон 2; ИаС 1 0,5; 5 ОМа РОО, 05; аминного азота 200 мг .7, .Культивирование вибрионов продол-.жают до концентрации 55-65 млрд.микробных клеток в 1 мл, переносятреакторную культуру в бутыль емкостью 5 л и добавляют мертиолат (5 гсухого мертиолата растворяют в 20 млдистиллированной воды) таким образом,чтобы его конечная концентрация составляла 0,17.Через 16-18 ч реакторную культурус внесенным мертиолатсм высевают напитательные среды для контроля специфической стерильности, Результатвысева учитывают в соответствии с режимом работы с особо опасными инфекциями через 8 сут. За это время приаутолиэе АТФ-аза переходит из мембран вибрионов в культуральную жидкость, из которой в дальнейшем получают фермент,После учета контроля, подтверждающего стерильность реакторной культуры, ее центрифугируют для отделенияразрушенных аутолиэом клеток при4000-6000 е в течение 25-30 мин,Осадок, содержащий разрушенные клетки отбрасывают, надосадок, содержащий АТф-азу, переносят в 10 л емкость и добавляют к нему сульфат аммония до 907. насыщения, растворяютперемешиванием и оставляют для формирования осадка при комнатной температуре на 16-18 ч.Через 16-18 ч насьпценную сульфатом аммония культуральную жидкостьцентрифугируют для получения осадкабелка при 4000-6000 я в течение 1520 мин. Надосадок отбрасывают, аосадок, содержащий АТф-аэу, в объеме0,25-0,3 л растворяют дистиллированной водой из расчета: 1 ч. осадка +1 ч. воды. Растворенный осадок 0,50,6 л Фильтруют через бумажный фильтри обессоливают на колонке с акрилексом Р. Для этого колонку размерами 45 х 500 мм наполняют гелем акрилекса Рв объеме 1 л уравновешенным0,005 М тис -НСГ буфером рН 7,5-8,0,На гель наносят 0,5-0,6 л растворенного дистиллированной водой осадкаи элюируют со скоростью 350-400 мл/ч.Сбор элюата проводят под контролемоптической плотности при 380 нм спомощью проточной спектрофотометричесхой кюветы.Полученный препарат изучают насодержание белка, полисахаридов, нуклеиновых кислот.На заключительном этапе полученияАТФ-азы применяют гель-хроматографию на колонке с биогелем АМ,Для этого колонку размерами 15 х 300 ммнаполняют бногелем Ав объеме45 мл, уравновешенным 0,005 М теисНС. буфером рН 7,5-8,0, и наслаивают2326 И ральнои жидк после отделе фрагментов к ток вибрионо ти 3 3, 2+ 161,6+6 54,7+12,7 бессоленный ферменсодерж щий препарат осле элюции на колонкбиогелем 6+76,3 4,55+0,15 4 после хр тографии ге лонке слем А,8 308+0,08 283+154,3 6472+1311 на него 25-30 мл обессоленного ферментного раствора. Элюцию проводят со скоростью 40-50 мл/ч. Фракции по 3-4 мл собирают на автоматическом коллекторе. Каждую фракцию изучают 5 на содержание белка (по поглощению длины волны при 280 нм и более объективно по методу Лоури) и на активность АТФ-азы. Об активности АТФ-азы судят по нарастанию концентрации не- О органического фосфора Р в инкубационной смеси, содержащей, М: ИаСР 10 , КСГ 2 10 ; МпСГ 5 1 О; АТФ-динатриевой соли (РеапаР) 3 1 ОЗ; таис -НСГ буфера 5 10 рН 7,6, 5Наряду с опытной пробой одновременно ставят две контрольные, одна из которых содержит все компоненты инкубационной смеси, но вместо раствора белка в нее вносят равный объем 20 воды, другая содержит исследуемый белок, но вместо инкубационной смеси вносят воду.Концентрацию неорганического фосфора определяют фотометрически по 25 известному методу. Расчет увеличения содержания неорганического фосфора проводят вычитанием из концентрации Р опытной пробы суммы концентрацийР; двух контрольных проб. За едини цу активности АТФ-азы принимают количество белка-фермента, которое спо 79 4собно за 1 ч инкубации прн 37 С высвободить из АТФ 1 мкг неорганического фосфора, Путем отношения АТФ-азной активности к /10 концентрации белка (так как в опытную пробу вносят 0,1 мл) рассчитывают удельную активность фермента. Результаты определения удельной активности АТФ-аэы холерного вибриона на различных стадиях получения представлены в табл . 1.Из табл . 1 видно, что по сравнению с исходным материалом (надосадком культуральной жидкости после отделения фрагментов клеток вибрионов) при обессоливании на колонке с акрилексом Рдостигается 4,82-кратная очистка, при гельхроматографии на колонке с биогелем АМ - 41,83-кратная степень чис-тоты препарата. Химический состав нативного и очищенного препаратов АТФ-азы представлен в табл. 2.Иэ представленных в табл. 2 данных видно, что по сравнению с нативным препаратом конечный продукт фермент АТФ-аза, содержит в 3,9 раза меньше нуклеиновых кислот и в 62,8 раза меньше полисахаридов в расчете на 1 мг белка. Выход фермента составляет 1,5-2 Х.(1,59%) П р и м е ч а н и е. Содержание нуклеиновых кислот и полисахаридов в надосадке культуральной жидкости после отделения фрагментов клеток вибрионов принимают за 1002. Редактор Н. Гунько Заказ 2737/27 Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета. СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная,Надосадок культуральной жидкости после отделения фрагментов клеток вибОчишенный препарат ферментаАТФ-азы холерного вибриона Показатели нуклеиновых Показатели поли- кислот, мкг нуклеи- сахаридов, мкг на . нового фосфора на . 371,7+35,7 28,2