Способ получения полисахарида

Оп ИСАНИ ЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз СоветскмкСоцмалмстмческмкРеспубпмк по 929015(331 фа аелам изобретений к открытий"Мицубиси Петрокемикал Компани Лимитед и Мицубиси Ока Фармасьютикал Ко., Лтц" Япония(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИСАХАРИДА Изобретение относится к технике получения полисахаридов путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов. и может быть использовано в качестве добавки. в корма, носителя для лекарств и косметических веществ или промышленных химикатов, предпочтительно смазок для бурения. Известен способ получения полиса харида путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов рода Рвецйопюпая на питательной среде в условиях аэрации, содержащей метанол в качестве единственного источни ка углерода, .источники азота, ФосФора и другие необходимые минеральные соли, с последующим выделениемполисахарида 1.Однако получаемый по известному20 способу полисахарид недостаточноактивен.Цель изобретения - увеличениеактивности полисахарида. Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу получения полисахарида путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов рода Рзецс 1 ощоплз на питательной среде в условиях аэрации, содержащей метанол в качестве единственного источника углерода, источники азота, ФосФора и другие необходимые минеральные соли, с последующим выделением полисахарида, из рода Рвецйотпопаз используют штамм Рвецйощопая рс 1 узассЬагодепев М, при этом культивирование ведут при рН 65-75 и 28-30 С в течение 48-72 ч. Способ осуществляют следующим образом.Ятамм Ряецйащопав ро 1 увассЬаго- оепеБ Мкультивируют на питательной среде в условиях аэрации, содержащей метанол в качестве единственного источника углерода, источ"929015 На пластичной. культуре бульонагара при 30 С в течение 21 дняформа неправильная, периферия волокзонистая, поверхность плоская, гладкая.На бульон-агаровой колотой культуре при 30 в течение 7 дней развитие по поверхности и вдоль верхнегонадреза,На бульон-метанольной (0,53 пообъему) агаровой пластинчатой культуре при 30 о в течение 30 дней Форма круглая, периферия волокнистая,3ники азота, фосфора и другие необходимые минеральные соли.Новый штамм Рзецоогюпаь ро 1 уассЬагоДепеа мвыделен из образцовпочвы в районе Иитосума, префектуры Ибараки, в Японии 1 мая 1975 г,Штамм хранится в техническом исследовательском институте микробиологической промышленности (Агенство промышленной науки и технологии фМинистерства международной торговли и промышленности Японии) в коллекции микроорганизмов под Ю 4054,этот новый штамм хранится такжев американской типовой коллекции15культур США под неизвестным номером,Морфологические свойства новогоштамма РяецсЬпюпаз ро 1 узасс 1 агодепеяМ-ЗО,26Рассматривают неподвижный куль"туральный бульон в среде метанольного бульона (О, 5 по объему) при 30 С48 ч.Форма и размер клетки - бацил- длиформа 0,3-0,5 х 1,0-2,5 мкм.Колония обычно одиночная, частично сдвоенная.Неподвижный с одним побегом, спорне имеется, грамм/окраска отрицатель- ЗВная, кислотная прочность отрицательная.Характеристика роста в различныхсредах,В бульонной культуре развивается.В бульонной жидкой неподвижной культуре при 300 С в течение 5 дней сильноеразвитие, образования пленки не имеется, осадок образуется, мутностьобразуется.40На бульон-агаровой культуре при30 С в течение 10 дней сильное развитие, Форма волокнистая, поверхностьгладкая, периферия волокнистая, прозрачность мутная, окраска оранжевая. 4Форма поднимающейся поверхности плоская, поверхность гладкая, окраскаоранжевая,На метанольной синтетическойжидкой среде, содержащей 0,5 г нитрита калия,1 г кислого фосфата калия, 0,5 г семигидрата сульфата магния, 10 мг семигидрата сульФатажелеза, 0,1 г дрожжевого экстракта и 1 об,4. метанола, растворенногов 1 л чистой воды, рН 7,0 при 30 Св течение 5 дней развитие обильное, имеется осадок, мутность, образования пленки не наблюдается,Физиологические свойства. Восстановление нитрата положительное, денитрификация отрицательная. Опытна метил-красный МР отрицательный,опыт на Р (фогс-Проскауер) отрицательный, индол не образует, сероводород не образует, крахмал не гидролизует. Утилизирует аммониевые солии нитраты, пигмент не образует,Уреаза, оксидаза, каталаза - положительно. Поглощение кислорода аэробное.Ьелатину не окисляет.Лакмусовое молоко окрашивает вкрасный цвет, пептонизирует.Температура развития 10-37 С, оптимальная температура роста 26-31орН развития 5-10, оптимально 6-8.Метиламин не утилизирует.Не образует газообразной кислоты из сахаров " арабинозы, адонитола, иноэитола, галактозы, ксилозы,клюкозы, сахарозы, ульцитола, сорбитала, трегалозы, мальтозы, маннитола, маннозы, лактоэы, рамнозы, рафФинозы, фруктозы, крахмала и глицерина.Не утилизирует сахара - арабинозу, иноэитал, галактозу, ксилозу,сахарозу, сорбитал, трегалоэу, мальтоэу, маннитол, маннозу, лактозурамнозу, раффинозу, фруктозу, крахмал, декстрин, инулин, метилглюкозид, рибоэу, сорбозу, Фукозу, целлобиоэу, мелебиозу и глицерин.Утилизирует глюкозу,Утилиэирует метанол, Не утилизирует метан.Не утилиэирует спирты - этанол,пропанол, изопропанол, бутанол, амиловый спирт, изоамиловый спирт;1,2-пропандиол; 1,3-бутандиол;1,4-бутандиол; 2,3-бутандиол; 1,5 пентандиол; 1,6-гександиол; 2, 5-гександиол; этиленгликоль, диэтиленгликоль 4"метилциклогексан.35 5 9290Не утилизирует органические кислоты - муравьиную, уксусную, фумаровую, лимонную, молочную, пировиноградную, изолимонную, кетоглутаровую, коричную, яблочную, оксиуксусную, гликолевую, глиоксиловуюи глюконовую.Количество метанола в питательной среде не должно быть выше 4объема среды, а вслучае непрерывной подачи метанола в среду егосодержание не должно быть выше 1по объему.В качестве неорганических источников азота используют нитрат аммония, калия, сульфат аммония и т.п,и дрожжевой экстракт, пептони т.п. в качестве природного источника азота.В качестве минеральных солей 20используют кислый. Фосфат калия,двухкалийный фосфат калия, сульфат магния, сульфат железа, хлористый кальций, сульфат марганца, хлорид натрия и т,п. В среду вводят 25также биотин, тиамины, дрожжевойэкстракт, кукурузную барду в случаенеобходимости.Культивирование проводят при,10-37 С, предпочтительно при 28-32 С,50при встряхивании или перемешиваниивоздухом, рН среды 5-10, предпочтительно 6-8 или 6, 5-7,5, продолжительность культивирования 24 ч, предпочтительно 48-72 ч.По окончании культивирования выращенный бульон разбавляют в 1 О 20 раз по объему, мицелий и другиетвердые вещества удаляют непрерывным центрифугированием при 1500 хх 60 мин и скорости обработки 20 л/чили периодическим центрифугированием при 1000 х 60 мин, Затем к отделенному бульону добавляют органическийрастворитель, например метанол, эта 45нол или ацетон в удвоенном объеме,или соль четвертичного аммониядля фракционирования осаждения белого волокнистого сырого полисахарида.Полученный полисахарид раство 50ряют в 5-15-кратном объеме воды иполученный раствор подвергают депротеинизации, например, нагреваниемпри 70-100 С, обрабатывают смесьюхлороформа и эмилового спирта (3:2)ипи обрабатывают трихлоруксуснойкислотой . Затем непрерывно илипериодически центрифугируют так жекак сырой полисахарид для удаления 15 6протеинов. К полученному верхнемуслою добавляют двойной объем метанола, этанолз или ацетона. Отделенный осадок тщательно промывают эфиром или этанолом, снова растворяютв 5-15-кратном объеме воды и деминерализуют диализом в проточной воде,обрабатывают ионообменной смолойи фильтруют через гуль, сушат вымораживанием и получают полисахаридв виде белой губки.Физико-механические свойстваполисахарида.Оптическое вращение (д ) =+48,4+2033 ,0,14 по объему водный растО овор),Средний молекулярный вес 2,0 хх 10 - 2,0 х 10 зависит от длительности ферментации),Элементарный анализ, ь: С 37,7++ 3,0; Н 5,80,5.Цветная реакция положительнав антроновой реакции и фенол-сернокислотной реакции. Полисахаридпредставляет собой кислотный элемент.ИК-спектр - характерные полосыпоглощения, см :при 3450 (5), 2940(:1), 1620 (М), 1400 М), 1040 (Я)и 890 (Ж),Растворим в воде, 1 н. НС 1, 1 н.серной кислоте и 1 н. водном аммиаке. Нерастворим в этаноле, эфире,ацетоне, хлороформе и диметилсульФоксиде. Вязкость 1000-3000 сПизмерена в его 1 вес.4 растворепри 20 ОС с помощью вискозиметратипа В 1 1,фирмы Токио Тейки, Япония). Сахарные единицы - пятна глюкозыи маннозы бумажной хроматографией после гидролиза, отношение сахарныхединиц глюкозы к маннозе 3 :2 по газовой хроматографии,Полисахарид белого цвета, аморфный и бесцветный в водном растворе.Из указанных свойств можно сделать вывод, что полисахарид, выделенный из бульона нового штамма М,обладает высокой вязкостью в водныхрастворах, которая не снижается даже в присутствии соли, например,КС 1"1 цС 11, Л 1 С 1, (М 4)Ю, илиМаГ 1, Вязкость водного раствораполисахарида незначительно изменяется при изменении рН среды, Поэтому он пригоден в качестве добавкив кори, носителя для лекарств и косметических веществ, или промышлен929015яных химикатов, йапример смазок длябурения.В медицине полисахарид М- Спригоден в качестве вещества, снижающего уровень холестерина. 5Ниже более полно дано объяснение снижения холестерина полисахаридом М-С на различных опытныхданных,Величина Д 50 полисахарида М-С 1 оне мене 5 г/кг в штамма 1 СР - Сдля самок и Самцов мышей и штаммаВистер для самок и самцов крыспри пероральном введении, в товремя как величина ЕД 5 оподавляющего действия на рост уровня холестерина в крови не более 5 мг/кг в случае гиперлипемии, вызванной Тритоном.Таким образом безопасная эона(1250(ЕЩ ) полисахарида составляет 2 О1000 раэ и больше, Подострая токсичность в течение 1 месяца введенияпоказывает, что нет никаких ненормальностей в веса тела, крови и органов при непрерывном введении 25500 мг/кг день; максимальная безопасная доза составляет 500 мг/кг,Полисахариды показывают высокуюбезопасность, как лекарство и применяются в медицине для улучшения зообмена липидов и предотвращения атерогеноза,Полисахариды можно вводить перорально, внутривенно, прд язык, внутримышечно или интраректально, предпочтительно перорально, обычно одинарными дозами 10-1000 мг 1-6 раза день для взрослых,В некоторых случаях полисахаридыможно давать после соответствующегорасщепления или сульфирования.Полисахарид М-С можно давать,как лекарство для улучшения липидного обмена и предотвращения атеросклероза, инфаркта миокарда, груднойжабы, размягчения мозга, мозговогокровотечения, гипертонии или гиперхолестермии, связанной с диабетом,Для перорального применения обычно используют капсулы, таблетки или50гранулы, в некоторых случаях порошки,сиропы или водные растворы, причемполисахарид М-С дает эффект в меньших дозах по сравнению с известнымипротивохолестерическими веществами,обладает безопасным пределом, не вызывает гепатотоксицности, обыцнойдля побочного действия,8П р и м е р 1. Получают питательную среду, содержащую в 1 л чистойводы следующие ингредиенты, г: кислый фосфат калия 1; нитрат калия 1;семигидрат, сульфата магния 0,5;хлорид калия 0, 5 дрожжевой экстракт0,1; метанол 32 и а мг: семигидратсульфата железа 10, дигидрат хлорида кальция 2 и хлорид натрия 2,7 литров среды помещают в ферментерс рН 7,0, стерилизуют 10 мин при120 о СВ среде такого же состава выращивают штамм Ряецйонопа ро 1 увасс 1 агодепе 5 Мв колбе Сакагуси, инокулируют в указанный ферментер, ведякультивацию при 30 С и аэрации 0,5объема/мин в течение 72 ч. Далеек бульону добавляют 100 л воды,мицелий отделяют непрерывным центрифугироаанием при 2000 об/мин и 7 л/ч.Затем отделенный фугат нагревают до80 С 1 С 15 мин, рН доводят до 3,5-4,5соляной кислотой для осаждения протеинов в изоэлектрической точке,затем протеины отделяют центрифугированием, рН слива доводят до 7,0,выпаривают до 25 л, обрабатываютсмесью хлороформ-амиловым спиртом(3:2) для депротеинизации и добавляют 50 л ацетона, при этом образуется вязкое вещество волокнистой струк"стуры. Это вещество отфильтровывают,тщательно промывают затем этанолом,снова растворяют в воде и подвергаютдиализу,Для отделения полисахаридов добавляют двойной объем ацетона. Полисахарид растворяют в 2 л чистой воды,затем сушат вымораживанием и получают 98 г очищенного полисахарида М-ЗО-С, Его продуктивность составляет 14 г/л культурального бульона.физико-механические свойства полученного полисахарида,Средний молекулярный еес 18 к 10по фильтрации геля и 12 х 10 порассеиванию света.Элементарный анализ, В: С 37 у 7,Н 5, 8.Цветная реакция положительна вреакции антрона и фенолсерной кислоты,Полисахарид М-С является кислотным полисахаридом.ИК-спектр поглощения. Характерныеполосы поглощения выражены волновымномером, сйг": 3450 (Я), 2940 М),1620 (М), 1400 (М), 1040 (Я)и 890 Ф 1 е9290 50 9где Б - показывает сильное поглощение, М - среднее поглощение,и Х - слабое поглощение.Полисахарид растворим в воде, в1 н. соляной кислоте, 1 н, серной кислоте и 1 н,водном аммиаке. Нерастворим в этаноле, эфире, ацетоне, хлороформе и диметилсульфоксиде.Вязкость 1000-3000 СП в 1/О-номводном растворе при 20 С и 60 об/мин 1 Она вискозиметре типа В (Фирмы "ТокиоТейки", Япония),Изменение вязкости водного раствора в зависимости от рН в диапазонерН 2-11, несколько большая вязкость 15при нейтральном рН (при рН 2 вязкость 930 сП; при рН 7-1250 сП ипри рН 11-1100 сП на вискозиметретипа ВЕ с адаптером НМдля небольшого количества при условиях 20 С,о0,23-ный водный раствор и 6 О об/минВ зависимости от температуры вязкостьизменяется следующим образом.В диапазоне 20-80 С вязкостьуменьшается при увеличении темпе- дратуры: при 20 С - 13500 сП, при80 С - 11100 сП на том же самомвискозиметре.Изменение вязкости водного раствора в зависимости от концентрации зОот 0,2 до 1 Ф вес/обьем : чем вышеконцентрация раствора, тем выше еговязкость, при 0,24 - 500 сП и при13 - 13500 сП и 20 о С,Снижение вязкости водного раствора полисахарида не наблюдаетсяв 53-ном растворе хлорида калия,магния, алюминия, сульфата аммонияили в насыщенном водном растворехлорида натрия.Полисахарид М-С гидролизуется 2 н. серной кислотой в герметичной трубке при 100 оС в течение 9 ч,Продукт реакции обрабатывают гидроокисью бария для удаления сернойкислоты, затем пропускают черезколонку с ионообменной смолой Довекс50 (Н форма) для удаления избытка ионов бария и тонких частицсульфата бария. Промывные жидкости выпаривают в вакууме. Концентратхроматографируют на бумаге, применяя.в качестве проявляющей жидкости смесь(4:1:5) и получают пятна глюкозы155и маннозы. Концентрат далее выпаривают досуха и превращают в соответствующее триметилсилильное производное, газовая хроматография которо 15 10го показывает отношение глюкозы к маннозе 3:2.Полисахарид М-С аморфный, белый, где водный раствор бесцветный.Полисахарид и его водный растворне имеют вкуса и запаза. Полисахарид более вязок, чем ксантановаясмола, при 20 С, 13"ном водном растворе, 60 об/мин и на таком же вискозиметре, вязкость полисахарида 2100 сП, у ксантановой смолы 1000 сП.Полисахарид М-С показываеттиксотропное свойство в его водномрастворе.Наблюдается слабое ультрафиолетовое поглощение около 280 мкм.Температура плавления полисахарида неопределенная, он разлагаетсяпри нагревании, переходя в науглероженное состояние.П р и м е р 2. Культивирование проводят, как описано в примере 1, получая культивированный бульон, содержащий полисахарид М-С. Бульон разбавляют смесью воды и метанола 1:1до 100 л и нагревают при 80 С 15 мин,Затем мицелий удаляют непрерывнымцентрифугированием при скорости7 л/час., рН слива доводят до 3,54, 5 соляной кислотой для осажденияпротеинов в изоэлектрической точке и затем протеины отделяют центрифугированием. Снова рН слива доводят до 7,0 и добавляют водный растворхлорида кальция до концентрацииО, 02 3, При дальнейшем центрифугировании получают пастообразный полисахарид, который обрабатывают 20 лметанола при осторожном перемешивании для удаления солей, фильтруют, отгоняют метанол и получают полиса харид в виде пасты. Пасту растворяют в 2 л чистой воды, сушат вымораживанием, получая 84 г очищенного полисахарида М-С. Производительность равна 12 г/л бульона.фармакологическйе свойства полисахарида М-С поясняются следующим образом.ОПыт 1. Берут самцов мышей штамма 1 СВ-,Ю, группами по 10 мышей, каждой из них внутривенно вводят по 800 мг/кг Тритона. Через 20-24 ч после введения в крови образуется пиковый уровень липидов крови, затем гиперликемию поддерживают более 24 ч, готовя таким образом опытных живот:ных. Затем опытную пробу полисахарида М-С растворяют в дистиллиро11ванной воде и дважды перорально вводят животным, а именно сразу после дачи Тритона и через 20-24 ч. Через 24 ч после последнего введения определяют уровень холестерина в сыворотке. Опыт 3,Берут самцов крыс штамма Вистар 3группы по 10 животных, В группе "нормарный контроль" находятся животные,которым дают обычную порошкообразнуюпищу, Подопытным животным группы"холестериновый контроль" дают пищу с добавлением 0,5 холестеринаи О, 5 желчной кислоты . В группеМ-С животным дают пищу, содержащую компоненты из группы "холестериновый контроль" и испытываемый полисахарид И-ЗО-С, приготовленный таким образом, что животные получаютдневную дозу 50 мг/кг. Одновременново всех группах поднимают холестеринв плазме: пищу дают в количестве10 г на 100 г веса тела в день. После кормления 14 дней определяют уровень холестерина в сыворотке,Опыт 2, Берут самцов мышей, как в опыте 1 по 6 штук в группе, и каж дой мыши вводят внутривенно стрептоозотоцин 200 мг/кг. Через 7 ч после введения поддерживают гиперлипемию в течение 14 дней и более для получения животных с гиперлипемией, вызванной стрептоозотоцином.Пробу полисахарида М-С растворяют в дистиллированной воде и перорально вводят животным одиночными дневными дозами 50 мг/кг в течение 5 дней после 7 дней с момента введе ния стрептоозотоцина. Через 24 ч после последнего введения определяют уровень холестерина. 929015 12В опытах 1-3 применяют такжегипохолестериновый агент (СР 1 В)для сравнения, Результаты опытов1-3 приведены в табл.1.Опыт 4. Берут самцов кроликовштамма новозеландские-белые группами по 10-14 животных. Животных, которым дают обычную пищу называют"нормальный контроль", пищу, содер 1 о жащую 0,67 холестерина - "холестериновый контроль", пищу с добавлениемиспытуемой пробы М"30-С - "группа,получившая испытуемое соединение",Уровень холестерина в плазме во всех5 группах одновременно повышают ежедневной дачей пищи 40 г/кг весатела в течение 20 недель. За этотпериод определяют уровень липидовв сыворотке. Через 20 недель всех - щ животных забивают, вырезают дорсальную аорту и изучают явление атеросклероза. Результаты приведены втабл.2Из данных табл,2 видно, что полисахарид М-С значительно подавляетрост липидов в сыворотке (общий свободный холестерин, триглицериды,фосфолипиды, липопротеин, свободныежирные кислоты); 65,9 атеросклероза обнаруживают в дорсальной аортев группе "холестеринового контроля"и в то же время 30-40 подавленияатеросклероза наблюдается в группеживотных, которым давали полисахаридМ-ЗО-С.35Снижающее действие на липиды всыворотке М-С происходит, видимо,за счет эффекта подавления поглощения и биосинтеза холестерина.Таким образом, полисахарид И-Сможно считать пригодным в качествепрактического вещества, снижающеголипиды в сыворотке и предотвращающего развитие атеросклероза.16 929015 3 сЧь СО сЧ 3 В м л Ю ОО ш В Ч СО". В Ш л Ю 13 3 3 1 1 1 1 1 1 31х11 1 31 Х 1 1 1оо3 1 1 ---- ь Ф 4 3 с юл СО Вс 3 СОь .л сЧ Ю Ш1 13 11 1Р9а1 ф 133 3ом 1 1 1 ф с 1 С 1 3 а1-1 1 3 )Х1Р 1 ОС Х о а а 1 9 1- 1 1 Хо о 3 9 Х с о х31 + М И +3 оо оЮ лх-31431 3 с1Щ гй 3О 1 а аЭОСфУ ОоРР Оа аЭ 331-1 И ищО1РСа3331 КЯ 33333(ОЫС 3817формула изобретения 9290 ю. Составитель А.бражниковаТехред Л. Пекарь Корректор В.Бутяга Редактор В.Бобков Тираж 505 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. Ч 5Заказ 3301/79 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,Способ получения полисахарида путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов рода Рзецйощопаз на питательной среде в условиях аэрации, содержащей метанол в качестве единственного источника углерода, источники азота, фосфора и другие необходимые минеральные соли, с по следующим выделением полисахарида,15 18отличающийся тем, что,с целью увеличения активности полисахарида, из рода Рзеийопюпаз исполь"зуют штамм Рзецйопюпаз ро 1 узассйатодепея И, при этом культивированиеведут при рН 6 5-75 и 28-30 С в течение 18-72 ч.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Заявка Франции У 2231718,кл. С 12 0 13/0 Ь, опублик. 1975.