Способ получения агрегата бактериальных клеток sтrертомусеs olivaceus

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАТЕНТУ Сотоз Соеатскнх Соцналнстичесннх Раснубннк(5) М. Кл С 12 И 9/92 С 12 Х 11/02// С 12 Р 19/24 Гееулврвтеаииый комитет СССР ав лоан иаворетеиий,и открытий(53) УДК 577.15, .07(088.8) Опубликовано 15. 05. 82,Бюллетень18 Дата опубликования описания 15. 05.82 Иностранецральд Бальтзер Б(72) Автор изобретени ум Иностранная фирМайлз Лаборатори 1) Заявитель Инк" т Мьг(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АГРЕГАТА БАКТЕРИАЛЬ КЛЕТОК ЯТРЕРТМУСЕЯ ОЫЧАСЕУЯ Изобретение относится к получению иммобилизованных ферментных препаратов, находящих практическое приме.нение в некоторых промышленных процессах, и касается, в частности, получения иммобилизованных (отвержденных) клеток микроорганизмов, содержащих глюкозоизомераэу, которые могут быть использованы в качестве источника этого фермента при конверсии глюкозы во фруктоэу.Известен способ получения бактериального клеточного агрегата, обладающего глюкозоизомеразной активностью, путем обработки клеток различными полиэлектролитными флоккулирующими агентами,Однако получаемый таким способом клеточный агрегат не обладает твердостью, достаточной для промышленного применения, в частности, для использования в реакторных слоях увеличенной толщины в процессах изомеризации глюкозы. Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности и достигаемому результату является способ получения агрегата бактериальных. клеб ток Яйгерйапусеяо 11 часеиь, заключающийся в том, что массу бактериальных клеток выдерживают при рН 6 5-8,5и температуре 15-60 оС в течение0,5-2 чв контакте с поперечносши" О вающим агентом, в качестве которогоиспользуют глутаровый альдегид в количестве О, 1-50 вес.Ф от веса сухихклеток.Однако данный способ также не 5 обеспечивает получения продукциис достаточной твердостью, необходимой для его практического использования в процессах конверсии глюкозыво фруктозу.О . Цель изобретения-повышение твердости получаемого бактериальногоклеточного агрегата.Цель достигается тем, что согласно способу получения агрегата бак929014 20 30 35 4 О 50 55 так и с трихлорангидридом циануровой кислоты одновременно,Глутаровый альдегид трихлорангидрид циануровой кислоты, и их сочетание, объединенные под обобщающимназванием глутарового альдегида,используют для реакции с полиаминовым полимером. При величине рН винтервале от 6 до 10 и температуреот 0 до 30 С в течение от 0,5 до2,5 ч. В целом поперечносшивающийреакционный продукт содержит от 12до 65,1 вес Д глутарового альдегидаи примерно от 34 9 до 88 вес,Зполиаминового полимера в пересчетена общий вес активнодействующих компонентов.Предпочтительно сшивающий агент,получаемый в результате реакциимежду глутаровым альдегидом и полиаминовым полимером, получают привеличинах рН от 8 до 9, температуре18 25 оС и в течение примерно 0 5 ч.Глутаровый альдегид должен присутствовать в молярном соотношении поменьшей мере 1;1 аминогрупп в молекулах полиаминового полимера, чтопрепятствует нежелательному поперечному сшиванию полиаминового полиме-,ра глутаровым альдегидом. Реакцию между только одним трихлорангидридом циануровой кислоты и полиаминовым полимером по предпочтительному варианту проводят при величинах рН среды от 8 до 9 и температуре от 0 до 10 С в течение от 1 до 2 ч. Трихлорангидрид циануровой кислоты должен присутствовать в молярном соотношении, равном по меньшей мере 1:1 аминогрупп в молекулахполиаминового полимера, что позволяет предотвратить нежелательное поперечное сшивание молекул полиаминового полимера галоидангидридом циануровой кислоты. В молекуле трихлор ангидрида циануровой кислоты, имеются три галогеновых реакционноспособных участка. Один из этих участков вступает в реакцию при температуре 00 С или выше, После завершения реакции на этом первом участке при температуре от 30 до 50 оС вступает в реакцию второй участок, а третий участок вступает в реакцию при температуре от 90 до 100 С. ЖелательноОпервоначально использовать для реакций с полиаминовым полимером только первье участки молекул трихлорангидрида циануровой кислоты. Образовавшийся поперечносшивающий реакционный продукт используют в реакции с бактериальными клетками, после чего нагревают в процессе сушки до повышенной температуры, оставшиеся активные участки галоидангидрида циануровой кислоты вступают в реакцию с молекулами полиаминового полимера с обеспечением дополнительного поперечного сшивания бактериального клет.чного агрегата.Реакцию между полиаминовым полимером и сочетанием глутарового альдегида с трихлорангидридом циануро 15,вой кислоты проводят в несколько стадий. СНацала проводят реакцию трихлорангидрида циануровой кислотыс полиаминовым полимером при величине рН от 8 до 9 и температуре от0 до 1 Ф С в течение от 1 до 2 ч. По предпочтительному варианту исходныереагенты для осуществления такойстадии следует использовать в молекулярном соотношении 1 моль три 25 хлорангидрида циануровой кислоты на 2 моль аминогрупп в молекулах полиаминового полимера. Затем добавляют избыточное количество глутарового альдегида и реакцию проводят в тех же самых условиях рН и температуры в течение 0,5 ч.Используемый поперечносшивающий реакционный продукт не является катионоактивным полиэпектролитом, поскольку аминогруппы в молекулах полиаминового полимера, которые первоначально сообщали этому последнему катионоактивные характеристики, к этому времени уже прореагировали с глутаровым альдегидом и/или трихлорангидридом циануровой кислоты, вследствие чего свободные группы уже отсутствуют.Бактериальные клеточные агрегаты получают путем введения массы бактериальных клеток в контакт с поперечносшивающим реакционным агентом полученным в соответствии с предлагаемым, при величине рН от 8 до 9 и температуре от 5 до 30 оС в течение от 0,5 до 1,5 ч. Поперечносшивающий реакционный агент используют в таких количествах и концентрации, что бактериальные клетки вступают в контакт приблизительно с 6,555 вес.3 активнодействующих компонентов поперечносшивающего реакционного продукта в пересчете на су"хой вес клеток.После завершения указанной реакции полученный бактериальный клеточный агрегат по предпочтительному варианту обычно экструдируют или подвергают формованию с сообщением продукту желаемой формы и сушат при температуре приблизительно 65 ОС в течение нескольких часов. Полученный сухой агрегат можно хранить до тех пор, пока он не понадобится для проведения ферментативного процесса. При этом высушенный агрегат повторно гидратируют и готовят к использованию.Полученные образцы подвергают испытанию на твердость с целью оценки их пригодности для использования в реакторах. Эта твердость выражается в стойкости к сжатию частиц бактериального клеточного агрегата, Испытания проводят с использованием разрывной машины "Инстрон" в сочетании с блоком сжимающей нагрузки Ио,СС 1 в соответствии с ранее описанной методикой. Этот прибор выпускается Фирмой Инстрон корпорейшн Кантон, штат Массачусетс,Ниже приводится процедура испытаний по определению твердости после повторной гидратации.Раствор для повторной гидратацииготовят путем смешения 9,68 г гексагидрата хлористого кобальта,28,0 г гидрата окиси магния и 56,0 гбезводной лимонной кислоты в 600 мл"дистиллированной воды при 45 ОС. Этусмесь далее перемешивают и нагреваютдо 60 С с растворением всех солей.Затем смесь охлаждают до 25 С и доводят величину рН до 8,5 добавлениемгидрата окиси натрия. Далее растворфильтруют и доводят его объем до1,0 л добавлением дистиллированнойводы. Порцию в 2,5 м указанного раствора смешивают с 130 мл воды, 70,3 гдекстрозы, 24,228 г трис-(оксиметил)-аминометана и доводят величину рН до 8,55 добавлением гидратаокиси натрия при 25 оС. Затем объемдоводят до 200 мл добавлением дистиллированной воды,Проводят конверсию 5 частиц высушенного бактериального клеточногоагрегата с использованием 2,5 млуказанного раствора для повторнойгидратации в чашке Петри и выдерживают при 60 оС в водяной бане в течение 1 ч, а затем оставляют стоятьпри комнатной температуре до охлаж 290148дения. После этого частицы удаляютиз раствора, удаляют также из него избыток поверхностной жидкости ипроводят испытания с применением разрывной машины "Инстрон", Перед применением данного прибора для про 1 О 15 го 25 зо 35 40 45 50 55 ведения измерений его подогревают в течение по меньшей мере 30 мин совместно со смонтированным на нем блоком сжимающей нагрузки. Устанавливают скорость движения ползунка на уровне 5,1 мм/мин и скорость движения диаграммы 51 мм/мин. Пере. водят ручку "Возврат" до половины хода, доводя ее до уровня 0,965 мм для поверхности блока нагрузки, Устанавливают ручку Длина испытываемой части образца" таким образом, чтобы очистить кромку чашки для образца. Задают на самопишущем приборе диапазон всей шкалы. Это обычно составляет 4,54 кг. Стандартизируют самопишущий прибор таким образом, чтобы считывать нулевое число с чашкой для образца на блоке нагрузки и 1 Фунтом (0,454 кг), с чашкой и 1 фунтом (0,454 кг) стандартного веса на блоке нагрузки. Помещают единственную частицу после повторной гидратации на чашку для образца,которая сцентрирована с ползунком. Вручную опускают ползунок на верхнюю часть частицы и нажимают кнопку "Ход". На самопишущем приборе считывают усилие в фунтах (килограммах) на расстоянии 0,03 дюйма 0,762 мм от точки,в которой ползунок касается частицы. Таким образом твердость выражается в усилии (в фунтах или килограммах), необходимом для сжатия частицы на 0,03 дюйма (0,762 мм), Этот эксперимент повторяют на нескольких частицах, а полученные результаты усредняют.П р и м е р 1. Поперечносшивающий реакционный продукт получают добавлением 2,25 г раствора БЕТЦ 1180, содержащего 0,675 г активно- действующего материала и 0,648 ммоль аминогрупп, в 100 мл 1,253-ного (вес на объем) раствора глутарового альдегида, содержащего 13,24. ммоль активнодействующего материала, при величине рН, равной 9, Эту смесь перемешивают в течение 30 мин, в результате чего получают раствор глубокой желтой окраски, Конечный продукт получают из реакционной смеси, которая содержит 64,9 вес.ь глута929 Культуру мутанта Яйтерйсапусезо 11 часеця ИВВЬ 3583 выращивают вферментере с перемешиванием и аэрацией, в котором содержалась соответствующая питательная среда. Величину 10рН питательной среды ферментора,содержащую массу бактериальных клеток, доводят до 8,2 добавлениемсоответствующих, буферных материалов,часть приготовленного раствора добавляют в порцию питательной средыферментора в таком количестве, которое необходимо дпя достижения эквивалента 14 вес.4 глутарового альдегида (21,6 вес. от всего количествареакционного продукта) в пересчетена сухой вес бактериальных клеток.По истечении 30-минутного промежуткавремени реакции при 25 С и величинеорН, равной 8,2, обработанню среду 25отфильтровывают. Затем фильтровальный пирог подвергают экструдированиючерез шприц с диаметром отверстия2,2 мм. Отформованные таким образомэкструдированные нити разрезают наотрезки длиной 30 мм и высушиваютв течение ночи при 650 С в печи спринудительной циркуляцией горячеговоздушного потока, Аналогичную порциюпитательной среды ферментора обрабатывают только одним глутаровым альдегидом при концентрации 14 вес.3 15 20 Таблица 1 Твердость, кг Добавляемое количество,вес.4 0,82 13,9 Контрольный 100 76,7 1,23 13,0 34,7 1,23 60 40,0 18,7 1 ф 5 44,4 55,6 1,64 29,8 65,1 воляет существенно повысить твердость в сравнении с той твердостью,которая достигается с использованирового альдегида и 35,1 вес./ полиаминового полимера в пересчете на общий вес глутарового альдегида и полиаминовый полимер. Глутаровый Полиаминовыйальдегид, полимер, вес.3вес. "ь Использование поперечносшивающего агента на основе глутарового альдегида и полиаминового полимера поз 014 10в пересчете на сухой вес бактериальной клеточной массы. Затем обработанные клетки отфильтровывают, экструдируют и высушивают таким же образом с получением контрольных частиц. Как контрольный продукт,так и продукт, получаемый по предлагаемому изобретению подвергают испытаниям на определение твердости, Твердость контрольного образца 0,364 кг, тогда как продукт, обработанный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает повышенной твердостью, равной 1,27 кг.П р и м е р 2. Порции питательной среды ферментера с микроорганизмом Бйгер 1 ащусек о 11 часецс, аналогичной упомянутой в примере 1, подвергают обработке только одним глутаровым альдегидом (контрольный эксперимент) и различными сочетаниями поперечносшивающих агентов при величине рН, равной 9, и температуоре 29 С,Различные поперечносшивающие агенты получают в соответствии с изложенным в приведенном примере 1 с использованием различных количеств глутарового альдегида и полиаминового полимера, Затем обработанные бактериальные клетки отфильтровывают, экструдируют, высушивают и подвергают испытанию на определение твердости.В табл.1 показана реакционная смесь для приготовления композиции, ,из которой получают поперечносшивающий реакционный продукт.ем в соответствии с известным способом только одного глутарового альдегида. 9290 20 35 П р и м е р 3. Поперецносшивающий реакционный агент получают растворением 0,188 г трихлорангидрида циануровой кислоты (0,64 ммоль) в 10 мл ацетона, а затем этот раствор при перемешивании добавляют к 70 мл водой, охлаждаемой льдом, с получением тонкодисперсного осадка.Порцию в количестве 2,25 г раствора БЕТЦ 1180 (содержащего 0,675 г активнодействующего материала и 0,648 ммоль аминогрупп) разбавляют добавлением 20 мл воды и добавляют смесь в суспензлю трихлорангидрида циануровой кислоты, Конечную смесь подвергают перемешиванию и выдерживают при величине рН 9 и температуре 0-5 ОС в течение 1-2 ч, после чего разбавляют до объема 100 мл. Трихлорангидрид циануровой кислоты растворяется, указывая на реакцию с полиамином. Этот реакционный продукт 25 получают из реакционной смеси, которая содержит 21,8 вес.Ф трихлорангидрида циануровой кислоты в качестве полиаминового колимера. Часть питательной среды, аналогичной указанной зр в примере 1, из ферментера с микроорганизмом ЯСгер 1 ощусея о 1 иасеи смешивают с цастью указанного реакционного продукта с достижением концентрации 32,0 вес.3 реакционного продукта в пересчете на сухой вес бактериальных клеток.0,2 (вес на объем) водного раствора бикарбоната натрия добавляют для поддержания величины рН на уровне 9. По истечении 40 1,5 ч при величине рН 9 и температуре 25 С обработанную питательную среоду фильтруют, экструдируют и высушивают, Другую часть питательной среды ферментера обрабатывают согласно из ложенному в течение 0,5 ц. В началь- ной стадии не добавляют бикарбоната натрия, но отфильтрованные клетки промывают раствором бикарбоната натрия концентрацией 1 вес,/ при величине рН 9 перед экструдированием и высушивают. Для получения контрольного продукта в отдельную порцию питательной среды из ферментера добавляют глутаровый альдегид при концентрации 14 вес.3 в пересчете на сухой вес бактериальной клеточной массы. Полученную массу обрабатывают глутаровым альдегидом в тецение 30 мин 14 1 7при величине рН 8,2 и температуре 25 С с последующим фильтрованием, экструдированием и сушкой, Твердость контрольного продукта 1 кг, тогда как в результате обработки указанным поперечносшивающим продуктом в течение 0,5 ч получают продукт с твердостью 1,73 кг, а в результате обработки им же в течение 1,5 ч достигают твердости 1,82 кг.П р и м е р 4, Поперечносшивающий реакционный продукт получают добавлением 4,5 г раствора БЕТЦ 1180 (содержащего 1,35 г активнодействуюцего материала и 1,296 ммоль аминогрупп) в 0,118 г (0,64 ммоль) тонко- измельченного трихлорангидрида циануровой кислоты в воду, охлаждаемую льдом. Величину рН доводят до 9 и поддерживают на этом уровне в ледяной бане (при ООС) в тецение 2 ч, Затем добавляют 1,25 г (13,24 ммоль) глутарового альдегида при величине рН 9 и низкую температуру поддерживают в течение приблизительно 0,5 ч,Смесь приобретает темно-желтую окраску. Реакционный продукт полуцают из реакционной смеси, которая содержит 4,3 вес.3 трихлорангидрида циануровой кислоты, 46,0 вес,1 глутарового альдегида (всего 50,3 вес,Ф глутарового альдегида) и 49,7 вес.Ф полиаминового полимера в виде глутарового альдегида . Порцию питательной среды, аналогичной питательной среде примера 1, из ферментера с культурой микроорганизма Яйгер 1 опусеь о 11 ча- сеиБ смешивают с порцией указанного поперечносшивающего продукта с достижением концентрации 30,4 вес.1 реакционного продукта в пересчете на сухой вес бактериальной клеточной массы. После истечения 0,5-часового реакционного периода при величине рН 9 и температуре 25 оС обработанную питательную среду фильтруют, промывают водным раствором бикарбоната натрия концентрацией 5 вес,Ф при величине рН 9, экструдируют и высушивают. Контрольный образец получают таким образом, как это описано в примере 3, Твердость контрольного продукта 0,364 кг, тогда как твердость, достигнутая с использованием указанного поперечносшивающего продукта достигает 1,73 кг,П р и м е р 5. Порции питательной среды из ферментера с культурой микроорганизма Я 1 герФощусся о 1 ю13 929014 14 сецк, аналогичной упомянутой в при- мере 1, обрабатывают только одним глутаровым альдегидом (контрольный эксперимент) и различными сочетаниями поперечносшивающих продук,тов при величине рН 9 и температурахО25 и 5 С. Во всех случаях поперечносшивающие реакционные продукты,которые используются, включают в себя 1 моль трихлорангидрида циануровой кислоты на 2 моль аминогрупп в полиГлутаровыйальдегид,вес, 4 Трихлорангидрид циануровой кислоты, вес.Ф Добавляемое количество, вес.4 Твердость, кг Ролиаминовый полимер,вес.й,75,8 6,0 38,4 0,96 47,4 1,41 3,8 48,8 29,5 12,8 87,2 1,50 55,0 100 Контрольный 0,55 44 5 2,0 13,5 52,0 15,9 2,6 18,8 в пересчете на общий вес активнодействующих ингредиентов. По предпочти тельному варианту эту композициюследует также применять в количестве17,5 вес.4 в пересчете на сухой весбактериальных клеток, В том случае,когда используют поперечносшивающий 50реакционНый продукт, полученный изглутарового альдегида, трихлорангидрида циануровой кислоты и полиаминового полимера, в соответствии спредварительным, вариантом, композицию следует получать из смеси 5554,9 вес,4 глутарового альдегида и3,6 вес.4, трихлорангидрида циануровой кислоты и 41,5 вес.Ф полиамино 1 вого полимера в пересчете на общий Как видно из приведенных данных,бактериальные клетки, обработанные поперечносшивающими реакционными продуктами согласно предлагаемому изобретению, обладают заметно повышенной твердостью в сравнении с бактериальными клетками, которые были обработаны в соответствии с известным способом только одним глутаровым альдегидом.В случае использования поперечносшивающего реакционного продукта,полученного из глутарового альдегида и полиаминового полимера, предпочтительную композицию готовят из смеси 571 вес,4 глутарового альдегида и 42,9 вес.4 полиаминового полимера аминовом полимере, Затем готовятсочетания, которые указаны в табл,2.Затем обработанные бактериальныеклетки фильтруют, экструдируют, высушивают и подвергают испытаниям наопределение их твердости. В табл.2 показана композиция реакционной смеси для получения 10 поперечносшивающего реакционного продута. Т а б л и ц а 29290 15 Формула изобретения Составитель О. СкородумоваТехред Ж. Кастелевич Корректор И. Муска Редактор А. Гульком Заказ 3301/79 Тираж 505 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д . 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,4 вес активнодействующих ингредиентов,По предпочтительному варианту этукомпозицию следует также применятьв количестве 18,2 вес.4 в пересчетена сухой вес бактериальных клеток.Все бактериальные агрегаты, полученные в соответствии с изложенным,проявляют способность к конверсииглюкозы во фруктозу. Практическоеосуществление предлагаемого способане ухудшает глюкозизомеразной активности,Основное преимущество и техникоэкономическая эффективность данногоизобретения состоит в достижениитвердости бактериального клеточногоагрегата после повторной гидратациив сравнении с бактериальными клеточными агрегатами, получаемыми по ранее известным способам,1, Способ получения агрегата бактериальных клеток 51 гер 1 ощ)гсея 011 часеиБ, предусматривающий выдерживание массы бактериальных клеток в контакте с поперечносшивающим агентом в щелочной среде в течение 0,5-1,5 ч,30 о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения твердости получаемого продукта, в качестве поперечносшивающего агента используют продукт взаимодействия 12-65,1 вес.Ф соединения, выбранного из группы,вклю 35 чающей глутаровый альдегид, трихлор 14 16ангидрид циануровой кислоты и их сочетание, и 88-34,9 вес.Ф водорастворимого катионоактивного полимерапродукта полимеризации эпихлоргидрина с алкиленполиамином формулыЖРИгде К - низший Си-Сй- алкилен,а Еи Йс - низшие С -С 6 - алкилы,причем указанный поперечносшивающий агент используют в количестве 6,5-55 вес.3 от сухого весаклеток, и процесс ведут при рН 8-9 итемпературе 5-30 оС с последующимвыделением целевого продукта,2. Способ по и.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что после выделенияагрегат сушат,3, Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве поперечносшивающего агента используютпродукт взаимодействия 57,1 вес,глутарового альдегида и 42,9 вес.3водорастворимого катионоактианогополимера в количестве 17,5 вес.Фв пересчете на сухой вес клеток. 4. Способ по и.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве поперечносшивающего агента используют продукт взаимодействия54,9 вес,Ф глутарового альдегида и 3,6 вес, трихлорангидрида циануровой кислоты, взятых в качестве глутарового альдегида и 41,5 вес. водорастворимого катионоактивного полимера в количестве 18,2 вес.3 1 в пересчете на сухой вес клеток,