327689

О П И С А Н И Е 327689ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советскнз Социалистнческик РесоубликК ПАТЕНТУ Зависимый от патенталено 03.т/1.1970 ( 1439201 Кл, С 12 с 1 13 00 иоритет 13 Х 1,1969,4616 пония Комитет по деламобретений и открытийри Совете МинистровСССР Опубликовано 26,1.1972. БюллетеньДК 615 363(088 8 ата опубликования Опсдия 17.111.19 Авторыизобретения трднцыи, Такаа и ИосирОн 51)ндя фирбуцу Каопия) Инос Умезава, Томио Такеуч Кендзи Маеда(Яп Иностран Зайдан Ходзин БихсейХама и Аояги, Ма Оками амада аявител ои аку Кен ПОСОБ ПОЛУЧЕН НГИБИТОРА ПЕПСИНА Изобретение относится к медицине, точнее к производству терапевтически активных препаратов, и касается способов получения ингибитора пепсина.В отличие от известных, предлагаемый способ получения ицгибитора пепсина предусматривает выращивание актиномицетов 511 ер 1 опгусех 1 ез/псеггз, 51 гер отдаете, пг ое 11 с о 1 из Оаг, 1 оуо/геггзЫ и 51 гер 1 огтгусез саерг/озггз в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при температуре 25 - 35 С. Вэделе 5 е ц.л.ого ирод)кч з к) льр.1- пой жидкости и мицелия осуществляют изве:тными приемами.П р и м е р 1. В коническую колбу емкостью 0,5 л помещают стерилизованную питательную среду, содержащую, %: 1,0 глюкозы, 0,75 пептоцд, 0,75 мясного экстракта, 0,3 хлористого натрия, 0,1 кристаллического сульфата магния, 0,1 однозамещецного фосфата калия и 0,1 лгл раствора солей (7 г/л кристаллического сульфата меди, 1 г/л кристаллического сульфата за (11), 8 г/,г кристаллического хлорида марганца и 2 г/г кристаллического сульфата цинка). Значение рН после стерилизации 7,0. Среду засевают штаммом МС 44- С 1 и выращивают на качалке при 2 С в течение пяти дней. Субстрат из 29 колб слива 1 от, фильтруют и экстрагируют бутанолом(2,4 л и 2,0 г), Экстракты сливают и упаривают в вакууме досуха, Получают 4 г неочищенного порошка цгпбтора пепсгша - пепстатина. Добавление 0,13,1 кг этого порошкав экспериментальный раствор обеспечивает50%-иое ицгибирование пепсина,П р и м е р 2. 2,1 г порошка, полученногокк описано в примере 1, рдстворяют в 30,илдистиллированной воды и пропускают через10 колонн) с 18 г актВрованОГО Гл 51Высот 1слоя 72 с 5 п) со скоростью 2 лл(лин. Для промывки адсорбецтд пропускают через колонку400 11,1 дистиллированной воды и 300 л 1,г 60%ого водного метанола. Пепстатин извлекают15 80% метанолом фракциями по 5 л.г. Фракии 1,содержащие пепстатин, смешивают и упаривают в вакууме досуха, получая 0,7 г порошка, дающего 50%-ное ицгибировацие пенснапри добавлении его в экспериментальный20 раствор в количестве 0,054 лгкг.П рм е р 3. Способом осанным в примере 1, готовят 4 .г культурального фильтрата, добавляют к нему 80 г активровдогоугля и перемешивают в течение 20 лгн. Уголь25 отфильтровывают, промывают 2 л воды и извлекают из него пепстатиц пропусканием 3,5 лметанола при 40 С. Элюат упаривают в вакууме досуха, получая 15 г неочищенного препарата, дающего 50%-ное цгпброванс цепЗО сина при добавлении его в эксперимецтдль60 65 3ный раствор в количестве 0,6 мке. Неочигценный препарат растворяют в 1 л воды и пропускают через колонку со 100 г активированного угля, получая в результате операций, описанных в примере 2, 1,5 г белого порошка, 0,06 лкг которого обеспечивает 50% -ное ингибированис пепсина.П р и м е р 4. Г 1 рспарат, полученный как описано в примере 3, подвергают далыгсйшей очистке, для чего 0,38 г препарата растворяют в 5 лг,г смеси растворителей, содержащей бутанол, уксусную кислоту, воду и бутилацетат в соотношении 4:1;1;1, и пропускают через колонку с 90 г спликагсля (диаметр колонки 2,2 ем). Пепстатин экстрагируют той же смесью растворителей, собирая фракции по 5 лл. Фракции, содержащие пепстатин (с 9 по 15), смешивают и упаривают, получая в остатке 0,27 г препарата, обеспечивающего 50% -ное ингнбирование пепсина при добавлении его в экспериментальный раствор в количестве 0,04 лкг, После кристаллизации препарата из метанола получают вещество, обсспе нгвающсс 50%-нос игггггбирование пепсина при добавлении его в экспериментальный раствор в количестгзе 0,02 лгкг.Пример 5, 0,4 г препарата, полученного как описано в примере 2, растворяют в 5 ггл смеси этилацетата и метанола (3;1) и хроматографируют на силикагеле как описано в примере 4, но с использованием в качестве растворителя смеси этплацетата и метанола (3: 1). Фракции элюата, содержащие пепстатин (с 10 по 20), смешивают и упаривают, получая 0,29 г препарата, который кристаллпзугот из метанола и получают 0,14 г иглообразных кристаллов пепстатина с т. пл, 224 - 226 С, аналогичных получешгым в примере 4,1 р им с р 6. 3000 л среды, аналогичной описанной д примере 1, заливают в ферментер емкостью 6000 л засевают 110 л культурального субстрата и осуществляют ферментацию при псремешивапии со скоростью 190 ооггггин и аэрации стсрилизодагшым воздухом в количестве 2500,глгии, После 65 час фсрментации д субстрат добавлягот 77,5 ке дикалита и отфильтровывают на фильтр-прессе, промывая осадок 200 .г воды. Фильтрат с промывной водой после доведения рН до 8,2 добавлением 3 н. едкого патра, экстрагируют 1400 л бутанола. Экстракт упаривают до обьема 105,г, отделяют выпавший осадок и продолжают упариванис до объема 10 л. Выпавший осадок отделяют, присоединяют к полученному ранее и растворяют в 16 л метанола и 1 пг 40 С. В раствор добавляют 1,5 кг а ктивированного угля, а затем фильтруют. Фильтрат охлаждают, отделяют выпавшие кристаллы, а к фильтрату добавляют горячий метанол, полученный после промывания осадка активированного угля (три раза по 8 л). Метанольный раствор упаривают до 1 г, охлаждагот и отделяют выпавший пепстатин.Остаток на фильтрпрессе обрабатывают 500,г горячего метанола, который затем 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 упаривают при пониженном давлении, Оста. ток после упаривания промывают 15 л горячего этанола, а затем растворяют в 20 л горячего метанола, в который затем добавляют 1 кг активированного угля. После фильтрования и упаривания до 1 л выделяют дополнительное количество кристаллов пепстатина.П р и м е р 7. 548 г пспстатина растворяют д 50 лгл метанола, добавляют 1,5%-ный раствор диазометана в эфире до появления желтого окрашивания и упарпвают полученный раствор в вакууме. Остаток перскристаллизовывают из метанола и получают иглообразный кристаллический продукт с т. пл. 249 - 251 С, 0,015 лгкг полученного сложного эфира обеспечивает 50%-ное ингибирование пепсина.П р и м е р 8. Спорами и мицелием штамма МС 210-А 1 засевают среду, содержащую, %: 2,5 глицерина, 0,5 мясного экстракта, 0,5 псптона, 1,0 дрожжевого экстракта, 0,2 хлористого натрия, 0,05 кристаллического сульфата молибдена, 0,05 двухзамещенного фосфата калия и 0,32 карбоната кальция, Перед посевом 100 мл этой среды заливают в коническую г(олбу емкостью 0,5 л и стерилизуют. Культуру выращивают па качалке при 27 С в течение 7 дней. Культуральный фильтрат из 50 колб сливают и извлекают псстатин экстракцисй 2000 ял и-бутанола. После упаривания при пониженном давлении получают 2 г порошка, 1,5 лкг которого обеспечивают 50%-ное ингибирование пспсина. Этот неочищенный порошок смешивают с 30 лг.г воды и пропускают полученную взвесь через колонку диаметром 1,5 елг с 18 е актиднроданиого чгля. Затем через колонку пропускают 300 лгл 30%-ного водного метанола и элюируют пеп. статин 80%-ным водным метанолом. Фракции, содержащие пепстатпн, упарнвают при пониженном давлении и получают 0,35 г препарата, обеспечивающего 50%-ное ингибиро. ванне пепсипа в дозе 0,3 лгкг. Г 1 ослс очистки, аналогичной описанной в примере 4, получают чистый кристаллический пепстатин.П р и м е р 9. Способом, описанным в примере 8, выращивают на качалке штамм МС 284-С 1. Г 1 епстатпн извлекают из 3 л культурального фильтрата экстракцией 1,5 л бу. танола, После выпаривания экстракта получают 1,5 г препарата, 0,35 лгкг которого обеспешваст 50%-нос шггибирование пепсина,Предмет изобретения Способ получения ингибнтора пепсина, от.гичагоигиггся тем, что актиномицеты 51 гер 1 отуеек гез 1 аееиы, БИер 1 опгуеез, агдегг 1 ео 1 из оаг. 1 оуоИеггая и 51 гер 1 отусез саезрЫояив выращивают в аэробных условиях на питательной среде, содерякащей источники углеро да, азота и минеральные соли, при темпера. туре 25 - 35 С, и выделяют целевой продукт из культуральной жидкости и мицелия известными приемами.