Способ получения человеческого инсулина или его аналогов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 19) (111 АЗ 4 С 07 К 7/40//А 37 02 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН ПАТЕНТУ КеяеГгот апс 18,ЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АНАЛОГОВ касается полипепти человеческого ино аналогов, которые ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ(71) Эли Лилли энд Компани ((72) Рональд Юджин Чанс и ДжАртур Хоффманн (ПБ)(56) Мхоп С.Н., Чаг 61 аы А.Спезас 1 оп оГ 1 пзц 1 дп асг 1 ч 1 гугде зерагагес 1 апй 1 пасгдче АВ СЬа 1 пз. - Иагиге, 1960, 18721-724.(54) СПОСОБ ПОЛУИНСУЛИНА ИЛИ ЕГО(57) Изобретениетидов, в частноссулина (ИН) и ег как биологически активные соединенияиспользуют в медицине. Для упрощенияполучения ИН используют другие восстанавливающие агенты. Синтез ИН ведут из сульфонатов А-цепи (А-ц) иВ-цепи (В-ц) человеческого ИН илиего аналогов в водной среде при общей концентрации белка в растворе5-10 мг/мл, массовом соотношенииА-ц/В-ц=(1-2):(1,5-1), рН 9-11,5 и0-22 С (0,5-24 ч) в присутствии тиолового восстанавливающего агента.Последний выбирают из группы: дитиотриетола, дитиоэритрола, меркаптоуксусной кислоты,-меркаптопропионовой кислоты или цистеина, и берутв количестве 8-15 мас.Е от общегоколичества А-ц и В-ц. Способ обеспечивает выход ИН до 257 с проведениемпроцесса в одном аппарате в однофазном растворителе. 2 табл.1 13Изобретение относится к усовершенствованному способу получения человеческого инсулина или его аналогов биологически-активного соединения, которое находит применение в медицине.Цель изобретения - упрощение процесса и повьппение выхода целевого продукта.П р и м е р 1. Б-сульфонат А-цепи свиного инсулина (360 мг) растворяют в 36 мл 0,1 М глицинового буфера (рН 10,5) и рН смеси доводят до 10,5 с помощью 5 н. ЫаОН. Б-сульфонат В-це пи свиного инсулина (300 мг) растворяют в 30 мл 0,1 М глицинового буфера (рН 10,5) и доводят рН смеси до 10,5 с помощью 5 н. ИаОН. Дитиотриетол (ДТТ) (123,4 мг) растворяют в 4 мл 0,1 М глицинового буфера (рН 10,5) и рН смеси доводят до 10,5 с помощью 0,2 мл 5 н. ИаОН.Растворы А- и В-цепей соединяют в смесь объемом 100 мл при комнатнойотемпературе (- 25 С), а затем добавляют 1,91 мл дитиотриетола (ДТТ) для обеспечения соотношения -БН -ББО3 1,04. Получающийся раствор осторожно перемешивают в открытом химическом стакане магнитной мешалкой при темопературе 4-8 С в течение 20 ч. Анализ с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения указывает на то, что выход инсулина составляет 193,8 мг, т.е. 297. от общего количества белка.40 мл этого раствора довели до рН 3,15 с помощью уксусной кислоты. Смесь подвергали гель-фильтрации на колонке Сефадекс С(Суперфайн, Бпрегйдпе) размерами 5 х 200 см, уравновешивали и элюировали 1 М уксуснойокислотой при 4-8 С. Фракции, содержащие инсулин (объем элюции около 2450-2700 мл), объединяют и лиофилизируют с извлечением 95 мг инсулина, что составляет 257. от общего количества белка. Свиной инсулин по данным электрофореза в полиакриламидном геле, аминокислотного анализа, инсулин-радиорецепторного анализа, жидкостной хроматографии и восстановления глюкозы в крови кроликов достаточно чистый продукт.П р и м е р 2. Приготавливают растворы Б-сульфонатов А- и В-цепей бычьего инсулина концентрацией 5 мг/мл в 0,01 М глицинового буфера (рН 10,5) 277902рН каждого раствора доводят до 10,5с помощью 5 н. МаОН. ДТТ (61,7 мг)растворяют в 4,0 мл 0,1 М глициновогобуфера (рН 10,5) и рН доводят до 10,5с помощью О, 15 мл 5 н. ИаОН. К 0,5 млраствора В-цепи добавляют 0,8 млраствора А-цепи и 0,035 мл раствораДТТ при комнатной температуре (25 С)для обеспечения соотношения -БН -ББОк з0,91, Получающийся раствор перемешивают при 4-8 С в течение 4 ч в открытом Флаконе. Анализ смеси с помощьюЖХВР показал, что выход бычьего инсулина составляет 1,96 мг или 307 отобщего количества белка.П р и м е р 3. Приготавливаютрастворы Б-сульфонатов А- и В-цепейбычьего инсулина, имеющие концентрацию 10 мг/мл, в О, 1 М глициновом буфере (рН 10,5). рН каждого растворадоводят до 10,5 с помощью 5 н, ИаОН.ДТТ (61,7 мг) растворяют в 2,0 млводы, дистиллированной в стекле. К 25 0,5 мл раствора В-цепи добавляют0,6 мл раствора А-цепи и 29,25 млраствора ДТТ при комнатной темпера-туре (л 25 С) для обеспечения соотношения -БН-ББО, 1,00. Получающийся Зо раствор перемешивают при 4-8 С в открытом флаконе объемом 3 м в течение20 ч. Анализ смеси ЖХВР показал, чтовыход свиного инсулина составляет3,81 мг или 357 от общего количества 35 белка.П р и м е р 4, Приготавливаютрастворы Б-сульфоната В-цепи человеческого (панкреатического) инсулинаи нескольких Б-сульфонатов А-цепей ао человеческих (панкреатическая иЕ.Со 1) и свиных (панкреатических)инсулинов концентрацией 5 мг/мл в0,1 М глициновом буфере (рН 10,5).рН каждого раствора доводят до 10,5 45 с помощью 5 н. БаОН. ДТТ (61,7 мг)растворяют в 4,0 мл 0,1 М глицинового буфера (рН 10,5) и рН доводят до10,5, добавляя О, 16 мл 5 н. ИаОН. К1,0 мл каждого раствора Б-сульфона тов А-цепей добавляют 0,5 мл раствора Б-сульфоната В-цепи и 0,05 млраствора ДТТ при комнатной температуре (25 С) для обеспечения соотношения -БН -ББО 1 09. Все растворы пе 3 уВ 5 ремешивают в прохладной комнате(4-8 С) в открытом флаконе в течение20-22 ч. Затем их анализируют с помощью ЖХВР с использованием в качестве стандарта панкреатического человеческого инсулина для вычисления выходов.Результаты приведены в табл. 1. А-цепь Человечес кий инсу" лин мг Свиной (панкреатический) Свиной(панкреатический) 27,1 1,99 Человеческий П р и м е р 5. Приготавливают раствор каждого из Я-сульфонатов А- и В"цепей человеческого инсулина концентрацией 5 мг/мл в О, 1 М глициновом буфере (рН 10,5). рН каждого раствора доводят до 10,5 с помощью 5 н. ЮаОН. ДТТ (61,7 мг) растворяют в 4,0 мл О, 1 М глицинового буфера (рН 10,5) и рН доводят до 10,5 с помощью 0,16 мл 40 5 н. ИаОН. К 0,5 мл раствора В-цепи добавляют при комнатной температуре 1,0 мл раствора А-цепи, а затем 50 мл раствора ДТТ для обеспечения соотношения -ЯН -ЯЯО равным 1,09. ПолуЧаю щийся раствор перемешивают при температуре 4-8 С в открытом флаконе объемом 3 мл в течение 22 ч, после чего анализ с помощью ЖХВР указывает на то, что выход человеческого инсулина равен 2,58 мг, что составляет 347 от общего количества белка.П р и м е р 6. Я-сульфонат А-цепи инсулина человека (328 мг) растворяют в 65,6 мл 0,1 М глицинового буфера (рН 10,5) и рН смеси доводят до 10,5 с помощью 75 мл 5 н. ИаОН. Я-сульфонат В-цепи инсулина человека (164 мг) растворяют в 32,8 мл О, 1 М глициновоз 13277904 го буфера (рН 10,5) и рН смеси доводят до 10,5, добавляя в нее 15 мл 5 н, КаОН. ДТТ растворяют в 4,0 мл О, 1 М глицинового буфера (рН 10,5) и Т а б л и ц а 1 рН раствора доводят до 10,5 с помощью 5 и. ИаОН,выхода Растворы А- и В-цепей соединяют в по отноше- стеклянном стакане объемом 150 мл нню к об при комнатной температуре ( 25 С) и щему белку добавляют 3,28 мл раствора ДТТ для обеспечения соотношения -ЯН -ЯЯОК3 1,09. Открытый стакан помещают в баню с ледяной водой в прохладной ком,00 26,7 15 нате и энергично перемешивают в течение 36 мин. Затем раствор перемешивают в течение 24 ч в прохладной комонате (4-8 С). Проведенный в этот мо,11 мент анализ с помощью ЖХВР определили выход, равный 148 мг или ЗОХ от общего количества белка,К 100 мл этого раствора добавляют 26,0 25 мл ледяной уксусной кислоты дотех пор, пока значение рН не стано вится равным 3,15. Весь материал подвергают гель-фильтрации на колонке 2,03 Сефадекса С(Суперфайн) размером5 х 200 см, уравновешенной и элюирован,5 ной 1 И уксусной кислотой при 4-8 фС. Все элюированные белки лиофилизуют, Пик инсулина (объем элюции 2465- 2781 мл) весит 125 г и представляет 29,43 извлеченного белка.Часть инсулинового пйка (95,5 мг) растворяют примерно в 9 мл 0,01 М трнс,001 ЭДТА,5 М мочевины - 0,03 НаС 1 буфера (рН 8,5 при 4 С). Смесь подвергают хроматографии через ион-обменную колонку размером ,2,5 х 90 см ДЭАЭ-целлюлозы (диэтиламиноэтил), уравновешенную тем же самым буфером. Белок элюируется при .4-8 фС градиентом концентраций ИаС 1 0,03-0,09 М в объеме 1 л в том жесамом буфере, а затем 1 л буфера, содержащего 1 М ИаС 1. Каждый из пиков обессоливают на колонках Сефадекс С(грубых) в 2 Х-ной уксусной кислоте и лиофилиэируют. Пик инсулина (объем элюции 878-1008 мл) весит 55,73 мг и составляет 842 извлеченного белка.Кристаллы цинк-инсулина получают растворением 11,90 мг пробы инсулинового (ДЭАЭ) пика в 240 мл 0,1 н. НС 1 с последующим быстрым добавлением 2,16 мл 0,043-ного раствора 2 пС 1 - 0,05 М цитрата натрия - 157 ацетона в стеклянной центрифужной0 6 40 5 132779 пробирке. Кристаллизация проходит в течение 72 ч при комнатной температуре (25 С), после чего супернатант извлекают и кристаллы дважды промывают в холодной воде с рН 6,1 с центрифугированием при 2000 об/мин при 3 С между промывками. Кристаллы повторно растворяют в 0,01 н. НС 1 для анализа.Полученный препарат человеческо го инсулина считают совершенно чистым после электрофореза в полиакриламидном. геле (одна линия), анализа аминокислот, инсулинового радиорецепторного анализа, инсулинового радио иммуноанализа, ЖХВР, дансилирования и УФ-спектроскопии, Анализ на крови кроликов давал активность, равную 26,3 1,8 ед. на мг безводного вещества. 20П р и м е р 7. Был приготовлен раствор Б-сульфонат А-цепи человеческого Е.со 11 И-формил-Гли 1 инсулина.и раствор Б-сульфоната В-цепи человеческого (панкреатического) инсу лина концентрацией 5 мг/мл в 0,01 М глициновом буфере (рН 10,5). рН каждого раствора доводят до 10,5 с помощью 5 н. ИаОН, ДТТ (61,7 мг) растворяют в 4,0 мг глицинового буфера 30 (рН 10,5). рН доводят до 10,5 с помощью О, 16 мл 5 н. ИаОН. К 1,5 мл раствора Б-сульфоната В-цепи добавляют 1,0 мл раствора ДТТ при комнатной температуре (25 С) для обеспечения соотношения -БН-ББО 1, 10. Раствор перемешивают в прохладной комнате (4-8 С). в открытом флаконе объемом 3 мл в течение 23 ч, после чего проводят анализ с помощью ЖХВР. Анализ показывает, что выход (М-формилГли-)-А человеческого инсулина равен/19,5 Е от общего количества белка. После подкисления до рН 3,15 с по мощью ледяной уксусной кислоты часть этого раствора подвергают гель"фильтрации на колонке Сефадекс С(Супер- файн) размером 1,5 х 90 см, уравновешенной и элюированной 1 М уксусной кислотой при 4-8 С. Пик (И-формилГли)-А человеческого инсулина (объем элюции 87-95 мл) собирают, берут из него аликвоту, а оставшуюся часть лиофилизируют. Белок считают чистым на основании анализа ЖХВР и аминокислотного анализа. Биологическую активность (М-формил-Гли )-А человеческого инсулина оценивают с помощью радиорецепторного анализа; активность составляет 17 Т по отношению к стандарту человеческого инсулина.П р и м е р 8. Готовили раствор А-цепи свиного Б-сульфоната концентрации 10 мг/мл в О, 1 М глициновом буфере (рН 10,5) и такой же раствор В-цепи человеческого Б-сульфоната (Е.со 11). А-В пул готовили, беря 2 мл раствора А-цепи на 1 мл раствора В-цепи.рН А-В-пула устанавливали равным 10,5 с помощью 5 н, ИаОН. Цистеин (121,2 мг) растворяли в 3,0 мл 0,1 М глицинового буфера (рН 10,5) и устанавливали рН полученного раствора равным 10,5, добавляя к нему 0,35 мл 5 н, БаОН. К 1,4 мл А-В-пула добавляли при комнатной температуре 52 мкл раствора цистеина, в таком расчете, чтобы соотношение между -БН и -ББО3 равнялось 0,95, Полученный растворЬперемешивали при 4-8 С в открытой пробирке объемом 3 мл в течение 20 ч, после чего проводили анализ на "пролактин из плаценты человека. Выход инсулина человека составлял 3,25 мг (23,2 Е от общего содержания белков).П р и м е р 9. Проведен рентгенографический анализ человеческого инсулина, полученного как полусинтетическим (ЮЧО) способом, так и способом рекомбинатной ДНК (ЬдЫ). Кристаллы человеческого инсулина имеют комбоэдрическую ячейку пространственной группы Н За=82,85 А, С =34,1 А и.почти изоморфны кристаллам 2-инсулина свиньи (а=82,50 1, С=34,0 А).1Точные фотографии кристаллов человеческого инсулина, полученного обои 1 и способами, не отличаются друг от друга и от панкреатического человеческого инсулина, однако между человеческим инсулином и инсулином свиньи имеются заметные различия в распределении интенсивностей.Тщательный кристаллографический расчет как ЮЧО, так и Ы, инсулинов с использованием разрешения 1,9 А, проведенный быстродействующим Фурье- методом наименьших квадратов, показывает, что в пределах ошибки эксперимента структуры обоих человеческих инсулинов идентичны и очень близки к инсулину свиньи за исключением С-конца цепи В. После оптимизации различия в расположении атомов в человеческих инсулинах ЮЧО и Ь 11 Д. состав790 8ствительной концентрации белка в каждом образце.Результаты, приведенные выше, показывают наличие реального, четкого оптимума до концентрации белка, равного 8 мг/мл для реакции соединения цепей человеческого альбумина.Исследование рН: соединение А+В цистеин.Цель: оценка оптимального значения. рН для реакции соединения А+В+цистеин.Методика: соединяют 16 мл раствора А-цепи и 5 мл раствора В-цепи в 0,1 М глициновом буфере с рН 10,5. Раствор цистеина получают растворением 121,2 мг в 3,0 мл глицинового буфера и последующим доведением рН до 10,5 с помощью 350 мкл 5 н. ИаОН. Аликвоты указанного ооъединенного раствора А/В, имеющие объем по 1,4 мл, доводят при комнатной температуре до указанных ниже значений рН. Прибавляют 57 мкл раствора цистеина, после чего рН сразу доводят до исходного значения. После этого каждый образец помещают в холодную комнату (6 С) и перемешивают в течение ночи в 3-миллилитровой .ампуле.1Результаты: был проведен ЖХВД-анализ через 24-27 ч проведения реакции при 6 С с использованием аликвот, разбавленных ледяной уксусной кислотой 1:2. Рассчитаны действительные выходы в реакции соединения цепей. Зависимость от рН обнаруживает четкий оптимум около рН 10,5.Вывод: в реакции соединения А+В+ +цистеин обнаружен четкий оптимум при рН 10,5.Исследование рН: соединение А+В.Цель: пбдробная оценка интервала рН около значения рН 10,5 в начале реакции соединенияцепей А+В для определения критических отклонений в значении рН и точного значения оптимального рН, приводящего к оптимальному выходу инсулина.Методика: 120 мг свиного А (ЯЯО 3) и 60 мг человеческого В (ББО ), полученного из Е. со 11 (игр Е), растворяют соответственно в 12,0 и 6,0 мл О, 1 М глицинового буфера с рН 10,5 и снова доводят до рН 10,5 с помощью 5 н. МаОН.61,7 мг ДТТ растворяют в 4,0 мп О, 1 М глицинового буфера и снова доводят рН до 10,5 с помощью 140 мкл 5 н, ИаОН. 7 1327 ляют; О, 15 А только для атомов основной цепи и 0,22 А для всех атомов. Эти различия меньше, чем различия между двумя молекулами в димере 2 2 п-инсулине свиньи. Конформация боко вой лизиновой цепи В 29 хорошо определяется для обеих молекул, причем в молекуле инсулина свиньи обнаружены две различные конформации. Атомы основной цепи ВЗО в обеих молекулах су О щественно сдвинуты, в частности у карбоксильных групп. Обнаружены также изменения структуры воды при сравнении кристаллических структур человеческого инсулина и инсулина свиньи 15 в области В 28-ВЗО.Влияние концентрации белков на реакцию соединений цепей А-В.Цель; подробная оценка оптимальной общей концентрации белковых це пей в реакции соединения цепей А+В инсулина человека. Методика: получают 7 мл раствора А (ББО ) из свиньи с концентрацией 25 мг/мл и 4 мл раствора В (ЯБО ) из Е.со 1 д (В-да 1) с5концентрацией 25 мг/мл в 0,1 М глициновом буфере с рН 10,5. 6,0 мл раствора А-цепи и З,О,мл раствора В-цепи объединяют. Затем объединенный раствор доводят до рН 10,5 с помощью 30 5 н. МаОН. ДТТ получают растворением 61,7 мг в 4,0 мл О, 1 М глицинового буфера с рН 10,5, и снова доводят до рН 1 б,5 с помощью 140 мкл 5 н. ИаОН. В объединенный раствор цепей А/В 35 прибавляют 1,64 мл раствора ДТТ.Оптимальное соотношение ЯН/ББО = =1,.20 было определено ранее с теми же ДТТ и цепями при концентрации белка, равной 10 мг/мл. Концентрация 40 белка в реакции соединения цепей А+В не должна существенно влиять на оптимальное содержание ДТТ.1Раствор, в котором проводится ре акция соединения, сразу разделяют на аликвоты и помещают в 11 ампул емкостью по 3 мл, содержащих различные количества О, 1 М глицинового буфера, Каждую ампулу перемешивают в течение ночи при 5 С.Действительная общая концентрация цепей учитывает данные аминокислотного анализа (88,8 мас.7 А-цепи,88 мас.й В-цепи), а также добавление ДТТ и эа данные факторы разбавления. 1/27 ЖХВД - анализ проводят сразу после проведения реакции в течение 22-25 ч. Данные по выходу рассчитывают на основе дей9 132779Укаэанные растворы хранят в упаковке из льда в течение подготовки индивидуальных реакционных образцов. Каждый образец полностью завершают до того, как начинают подготовку сле-,5 дующего образца.Следующий эксперимент проводили прибавлением реагентов в заданном порядке в открытые 3-миллилитровые ампулы и перемешиванием в холодной ком нате (6 С) с помощью магнитной мешалки.Доведение рН проводят быстро и очень точно. Перечисляемые ниже результирующие значения рН представляют собой точные исходные значенияорН при 6 С, при которой реакцию начинают и проводят.Результаты: после проведения реакции в течение 4-5 ч несколько об- Л разцов подвергнуты прямому анализу с помощью ЖХВД. После проведения реакции в течение 1 дня все образцы были подвергнуты анализу с помощью ЖХВД.Данные ЖХВД, рассчитанные относительно ЖХВД-анализа стандартного инсулина свиньи.Приведенные данные ясно показывают, что рН 10,5 соответствует оптимуму для начала проведения реакции соединения А+В.Проведенные опыты показывают, что рН является крайне важным фактором, определяющим хорошие выходы инсулина. Первоначальный рН, равный 10,5, 35 при данной температуре реакции должен соблюдаться во всех других реакциях соединения.Для получения максимального выхода инсулина нет необходимости далее 40 поддерживать первоначальный рН реакции, равный 10,5. Эксперимент по проведению реакции соединения свиной цепи А (ББО )4 че ловеческой цепи В (ББО ) обнаруживает 6 достаточно воспроизводимых выходов реакции соединения; 23,6;24,7; 23,5; 23,0; 23,0 и 23,1 Ж со средним выходом 23,5 Е. 50Выводы; этот эксперимент ясно показывает, что оптимальным значением рН является 10,5, а также что в реакции соединения А+В исходное значение рН играет решающую роль. 55Реакция соединения А+В и цистеин (ЦИС),Цель: определить, можно ли использовать аминокислоту цистеин в качест 0 1 Ове восстанавливающего тиол недорогогоагента в реакции соединения цепейА+В.Методика: свиную А (ББО ) и Е.со 11 В (ББО ) используют для получениясмешанного раствора А/В с концентрацией 10 мг/мл в глициновом буфере срН 10,5.Раствор 1.-цистеина в форме свободного основания (м.в.=121,16) получают растворением 121,2 мг в 3,0 млО, 1 М глицинового буфера, после чего рН доводят до 10,5 с помощью350 мкл 5 н. ИаОН,Различные количества цистеина прибавляют к 1,4 мл аликвотам смешанного раствора А/В при рН 10,5, Через17-21. ч проведения реакции при 6 Спроводят ЖХВД-анализ.Результаты: получена зависимостьот БН/ББО , типичная для многих зависимостей для ДТТ. Оптимальный выход, равный 23,37 хорошо сравнимс выходом белка, равным 24-27 и получаемым с ДТТ. Оптимальные выходы.как для ДТТ, так и для цистеина, получены при одинаковом соотношенииБН/ББО =1, 2.Выводы; в реакции соединения цепей А+В цистеин работает также, какДТТ.Реакция соединения А+В с меркаптопроционовой кислотой и с меркаптоянтарной кислотой,Цель; определить, можно ли использовать Р -меркаптопропионовую кислоту(сокращенно МПК) или меркаптоянтарную кислоту (сокращенно МЯК) в качестве восстанавливающих тиол агентовв реакции соединения цепей А+В.Методика: свиную А (ББО )4 и Е.со 11 (ББО) используют для получениясмешанного раствора А/В с общей концентрацией 10 мг/мл в глнциновом буфере с рН 10,5, Для каждого образцаиспользуют по 1,4 мл этого смешанного раствора А/В.-Меркаптопропионовую кислоту используют в виде раствора 87 мкл этойкислоты в 4,0 мл глицинового буфера,причем рН доводят до 10,5 с помощью200 мкл 5 н. МаОН. Меркаптоянтарнуюкислоту используют в виде раствора150,1 мг этой кислоты в 3,5 мл глицинового буфера, причем рН доводят до10,5 с помощью 700 мкл 5 н. МаОН.Результаты: каждый образец перемешивают в течение ночи при 6 С и подвергают ЖХВД-анализу.1327-Меркаптопропионовая кислота приводит к приемлемым выходам инсулина,а меркаптоянтарная кислота дает оченьплохие выходы. Оптимальное значениедля МПК БН/ББО =1,40 и оно вьппе, чемв предыдущих исследованиях с этимицепями (выход инсулина 163).Выводы:-меркаптопропионовая кислота приемлемо эффективна в реакциисоединения цепей А+В, а меркаптоян- Ю.тарная кислота как агент декарбоксилированного тиола весьма плоха.Меркаптоуксусная кислота и ортомеркаптобензойная кислота.15Цель: определить, можно ли использовать меркаптоуксусную кислоту (МУК)или орто-меркаптобензойную кислоту(МБК) в качестве восстанавливающеготиол реагента в реакции сОединенияцепей А+В.Методика: свиную А (БЯО ) и Е.со 1 ь. В (ББО ) используют для получениясмешанного А/В раствора с концентрацией 10 мг/мл в глициновом буфере с 25рН 10,5, Для каждого образца используют по 1,4 мл этого смешанного А/Враствора.Меркаптоуксусную кислоту используют в виде раствора 71 мкл этой кисло- З 0ты в 3,9 мл глицинового буфера, причем рН доводят до 10,5 с помощью300 мкл 5 н, ИаОН, Орто-меркаптобензойную кислоту используют в видераствора 154,2 мг этой кислоты в3,8 мл глицинового буфера, причемрН доводят до 10,5 с помощью 400 мкл5 н. ИаОН.Результаты: каждый образец перемешивают в течение ночи и одвераютЖХВД-анализу. Затем выход инсулинарассчитывают.тМеркаптоуксусная кислота по сравнению с ДТТ и цистеином приводит кхорошим выходам инсулина, хотя в данном случае оптимум соотношения ЯН/ЯЯОочень широк (1,2-2,0, выход 19,720,5 ). Выходы с использованием орто-меркаптобензойной кислоты существенно ниже (до 8,6 Ж),50Вывод: в реакции соединения А+Вмеркаптоуксусная кислота весьма эффективна, а орто-меркаптобензойнаякислота значительно менее эффективна.Реакция соединения А+В с меркаптоэтанолом .или цистамином.Цель: определить, можно ли использовать в реакции соединения цепейА+В Я -меркаптоэтанол или цистамин 90 12(меркаптоэтиламин) в качестве восстанавливающего тиол агента.Методика: свиную А (ЯБО ) и В (БЯОз) из Е.со 1 используют для получения. смешанного раствора А/В с концентрацией 10 мг/мл в глициновом буфере с рН 10,5. Для каждого образца используют по 1,4 мл этого смешанного раствора А/В.Я -Меркаптоэтанол используют в виде, раствора его 70 мкл в 4,0 глицинового буфера, причем рН доводят до 10,5 с помощью 200 мкл 5 н. МаОН.Результаты: кажцый образец перемешивают в течение ночи при 6 С и подвергают ЖХВД-анализу. Выход инсулина рассчитывают. Оптимум соотношения БН/ЯБО равен 1,25 как для У -МЭ, так и для меркаптоэтила.:ина, и совпадает с оптимумом для ДТТ и цистеи-на, однако максимальные выходы инсулина (8-9 Е) существенно ниже.Вывод: меркаптоэтанол и цистамин не эффективны в реакции соединения цепей А+В.Реакция соединения А+В: цистеин по сравнению с ДТТ.Цель: сравнение цистеина и ДТТ в реакции соединения А+В по эффективности соединения цепей А и В.Методика: растворы цепей А, В и объединенный раствор А/В получают в глициновом буфере (0,1 М) с рН 10,5. Различие количе.ства растворов цистеина или ДТТ прибавляют к 1,4 мл аликвотам объединенного раствора А/В и перемешивают в 3-миллилитровых открытых ампулах в течение ночи при 6 С.Результаты: были проведены расчеты выхода, ЖХВД-анализ и расчеты БН/ЯЯО . Максимальный выход инсулина в реакции соединения А+В составляет 947 от максимального выхода, получаемого с ДТТ. Однако пик зависимости от БН/БЯО для цистеина более широк (1,0-1,5) чем для ДТТ, (1,2-1,3) и это определяет преимущество способа получения. Выводы: цистеин приводит только к 90-957 от максимального выхода, однако дает более широкий пик зависимости от БН/ББО по сравнению с ДТТ в реакции соединения цепей А+В.. Температурное исследование: реакция соединения А+В.Цель: изучение зависимости скорости реакции и выхода инсулина при соединении цепей А+В человеческого инсу 13 1327790лина от температуры проведения реакции.Методика: 149 мг А (ББО ) из свиньи и 70 мг В (ББО ) из Е.со 11 гр Е растворяют соответственно в 14,9 и 7,0 мл 0,1 М глицинового буфера и доводят до рН 10,5 с помощью 5 н. ИаОН. Получают ДТТ в концентрации 61,7 мг в 4,0 мл буфера и доводят до рН 10,5 с помощью 140 мкл 5 н. ИаОН.Образцы трех реакций соединения получак 1 т при различных температурах в ампулах емкостью 15 мл так, как указано ниже. Все растворы охлаждают до -1 С. В этой серии экспериментов А/В=2,0, а БН/ББО = 1,11.Через различные промежутки времени эти образцы после разбавления 1:2 уксусной кислотой проверяют на содержание человеческого инсулина с помощью ЖХВД"8/25 анализ. Количественная оценка основана на Уф -анализе свиного инсулина при 15,5 мм/мкг, 3=0,2.Результаты: через 1 сут. образцы снова оценивают для определения конечного выхода инсулина.Анализ полученных результатов показывает, что при комнатной температуре реакция соединения начинает протекать.очень быстро, но в течение короткого промежутка времени (3 ч), образование инсулина прекращается при низком выходе инсулина (9,87), максимум достигается за 3-5 ч,содержание инсулина медленно падает (через 22 ч выход 4,87). При 6 С реакция образования инсулина протекает несколько быстрее, чем при 0 С до времени проведения реакции, равного 6 ч, однако конечные выходы при времени проведения реакции 23 ч практически одинаковы (соответственно 24,4 и 24,73). За исключением проведения реакции при комнатной температуре не было обнаружено разложения инсулина эа счет разрыва дисульфидных связей вплоть до времени проведения реакции, равного 24 ч.Исходя иэ реакционных зависимостей в табл, 2, приведены для каждой реакций соединения 1,2 , или время, при котором достигается половина от максимального выхода инсулина, Таблица 2 Максимальный выход инсулина,7 Образец Т, С24,7 171 24,4126 10 2 22 18 9,8 Осуществление предлагаемого способа позволяет повысить выход до 257 с 1-27 и упростить процесс за счет проведения процесса взаимодействия Б-сульфонатов А- и В-цепей инсулина в одном аппарате в однофазном растворителе. формула изобретения Способ получения человеческого ин сулина или его аналогов путем взаимодействия Б-сульфоната А-цепи человеческого инсулина или его аналога сБ-сульфонатом В-цепи человеческогоинсулина, или его аналога в воднойсреде в присутствии тиолового восстанавливающего агента и кислорода воздуха, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта,процесс проводят в присутствии тиолового восстанавливающего агента, выбранного из группы, состоящей из дитиотриетола, дитиоэритрола, меркаптоуксусной кислоты, -меркаптопропионо 15Зависимость 1 от темпера 1/2 ма кстуры представляет собой прямую линию.Следовательно, температура обратнопропорциональна 1,, однако непосредственно не связана с конечнымвыходом инсулина.Выводы: проведение взаимодействиясоединений А+В при 0 С по сравнениюс проведением процесса в холодной 25 комнате (6 С) несколько замедляет реакцию, однако приводит к тому же самому конечному выходу инсулина (24257). Проведение реакции соединенияпри комнатной температуре приводит к 30 снижению выхода. Реакцию соединенияцепей А+В оптимально следует проводить при 0-6 С в течение 24 ч,1327790 16 воре 5-10 мг/мл, массовом соотнойении А-цепи и В-цепи 1:1,5-2:1 при рН 9-11,5, температуре 0-22 С в те" чение 0,5-24 ч. 15 вой кислоты или цистеина, взятого вколичестве 8-15 мас.Е от общего количества Б-сульфонатов А-цепи и В-цепипри обЩей концентрации белка в растСоставитель В. ВолковаРедактор Н. Киштулинец Техред Л.Олийнык . Корректор А. Ильин Заказ 3398/58 Тираж 347 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5