Способ получения пептидов

ПИСЗОБРЕК ПАТ Союз Советских Ссщиалистических Республик(32) 2 3. 0 осударствеииый комитет СССР по делам иаобретеиий и открытий(33) Швейцари яо 050779, Бюллетень4/7 64.4.8. 8) Опубликов вания описания 08077 ата опу ИностранецЛарс Гундро Свендсен (Норвегия)я Иностранная фи ффПентафарм А (Швейцария)(71) Заявит 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДО 1Изобретение относится к способам получения пептидов, содержащих хромофорную группу.Известен способ связывания хромофорной группы с С-концевой аминокислотной группой 1 путем конденсации защищенной по-аминогруппе аминокислоты с изоцианатом.В пептидной хймии широко используют при конденсации пептидных фрагментов метод активированных эфиров 2) и различные способы снятия концевых И-защитных групп 3).Целью изобретения является получение новых пептидов с хромофорной группой, которые могут найти применение в биохимии.Предлагается способ получения пептидов ббщей формулы: о динение в" гда В-НН лицинг) где з гекса ствии орган ной т получ де В - водород,-нафт алин зол- суль ацильная В 3 де В - алифатич ный оста углеродаВ" -2-аргинин-МН-В ) НУгобрабатывают 2 н, Нвг в ледянойной или во трифторуксусной,или ксусв беэп-толуольная-,2- в ,метан- или бенфонильная группа ил группа формулыС (0)- еский углеводородток с 1-7 атомамифенилалкиловый остаток с 1-3 атомами углерода в алкильном остатке,циклогексиловый или алкилокси остаток с 1-5 атомамиуглерода в алкильном остатке;4 метокси-нафтиламнд, п-нитроанилид, 2-нафтиламид; - анион минеральной или органической кислоты.соб заключается в том, что соеформулы-2-аргинин-ОН) . НУ (2) - блокирующая-аминогруппузащитная группа;- имеет значения, указанныеранее; подвергают взаимодействию с изоцианатом формулыС=Я-В, (3) ачения В указаны в триамиде етилфосфорной кислоты в присутодного эквивалента третичного ческого основания, при комнатмпературе в безводной среде; нное при этом соединение фор673)65 3водной муравьиной кислоте, или газообразным хлористымводородом в диоксане в безводной среде, при комнатной температуре; полученный лри этомпродукт ФормулыН-Е-аргинин-ИН-В 2 НУ (5)обрабатывают в диметилформамиде эквивалентнымколичеством третичного органического основания при комнатнойтемпературе и полученное при этомсоединение Формулы(7)где В - активная сложноэфирнал группа;В - одна из групп, обозначенных6через й , значение которойуказано ранее, или алкоксикарбонильная группа, алкильный остаток которой имеет,по крайней мере, один атомводорода у Ф -атома углерода и содержит до 10 атомовуглерода, полученное приэтом соединение формулы-ИН-.В ) НУ (8)обрабатывают если В -В 2 н.НВг в ледлной уксусной или трифторуксусной,или в безводной муравьиной кислоте,или газообразным хлористым водородомв диоксане в безводной среде при комнатной температуре и получают(Н-глицинпролин-Е аргинин-ИН-В 1 2 НУ (9)последнее соединение растворенноев диметиЛформамиде, пры обработкеэквивалентным количеством третичного органического основания при комнатной температуре переводят в соединение Формулы(Н-глицин-Е пролиларгинин-ИН-йф ) Н., (10)которое подвергают взаимодействию ссоединением Формулыйт (11)где значении й указаны ранее йимеет те же значениичто и В, илиозначает хлор или бром, причем еслиВч - х 1 ор или бромр то третичиое органическое основание применяют в количестве, эквивалентном количествусоединения (11), процесс ведут в диметилформамиде при температуре от-10 до 26 С,Элюаты анализируют путем тонкослойной хроматографии . При этом применяют покрытые гелем двуокиси кремнил Ф 254 (фирмы Мерк) стеклянныепластинки. длл проявления тонкослойных хроматограмм используют стгедующие системы растворителей:А хлороФорм-метанол (9:1)Б н-пропанол-этиловый эфир уксус ной кислоты-вода (7: 1: 2)В н-бутанол-уксуснал кислота-вода,(Зг 1:1),4Для обнаружения хроматограмм используют вначале ультрафиолетовыйсвет, потом реакцию со смесью хлор-толуйдин .В данном описании применяют следующие сокращения;5 арг - 2-аргинингли - глицинпро - Е -пролинкбо . - карбобензоксиГМПТА - триамид И,И,И,И,И,И 10 -гексаметилфосфорной кислотыНА - нафтиламидМеО - метоксиОпНП - п-нитрофеноксипНА - п-нитроанилид2-НА - 2-нафтиламидП р и м е р 1. И -кбо-гли-проС-арг-пНА НС 1а) кбо-арг-пНА НС 1.В круглодониой трехгорлой колбеемкостью 250 мл растворяют 16,0 г(47,0 ммоль) высушенного иад пятиокисью фосфора кбо-арг-ОН НС 1 в90 мл абсолютного ГМПТА без доступавлаги при 20 С. К полученному раствору лрибавллют при комнатной температуре сначала раствор 4,74 г(47,0 ммоль) трнэтиламина в 10 млГМПТА и затем 16,4 г (100 ммоль) п-нитрофенилизоцианата (1 ООЪ-ный избыток) по лорцилм. После выдержки втечение. 24 ч при 20 С ГМПТА болыаейчастью отгонлют в вакууме. Продуктэкстрагируют неоднократно ЗОЪ -иойуксусцой кислотой. Остаток выбрасывают, Объединенные экстракты уксусной кислоты длл дальиейщей очисткинаносит на уравновешенную ЗОЪ-иойуксусной кислотой колонкуфсефадекс Г 15 и продукт элюируют 40 ЗОЪ-ной уксусной кислотой, фракциюэлюата,содержащую продукт,.который может быть расщеплен обработкой трипжном с освобождением п-нитроаниллна,подвергают сукке вымораживанием, Получают 12,6 г аморфного пора,.ка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В,Вычислено,Ъ", С 51;67; Н 5,42;И 18 08 Сг 7 6 З50 Са Н И,ОСгНайдено, Ъ, фС 51, 29Н 5И 17,92; СС 7,50 .б) И ф -кбо-гли-про-арг-пНА НС 14,65 г (10 ммоль) соединении кбо-арг-рНА НС 1 обрабатывают 40 мл2 й. Нйг в ледяной уксусной кислотебез доступа влаги при перемеаиваииив1 ч при 20 С. Пептидное производноепри этом растворяется с выделением 60 СО. Реакционный раствор при сильномперемоаивании прибавляют по каплямк 250 мл абсолютного эфира, в осадоквыпадает (2 Нвг)Н-арг- ЛНА,Осадокотфильтровывают, просеивают абсолют ным эфиром (4 х 100 мл) дпл удаленил60 образующегося в качестве побочногопродукта бензилбромида", а также избытка НВг и уксусной кислоты, Продукт сушат в вакууме над пластинками БаОН, выход количественный. Сухой(10 ммоль) триэтиламина. Образующийся осадок триэтиламина НВг отфильтровывают; промывают небольшим колИ 1чеством холодного диметилформамида.Фильтрат охлаждают до -10 С и прибавляют к нему 4,70 г (11 ммоль) кбо-гли-про-ОпНП. Через несколько часовтемпература реакционного раствораподнимается до 20 С. Раствор вновь 15охлаждают до -10 С и буферируютО, 35 мл (2,5 ммоль) триэтиламина.Еще через 16 ч прибавляют 0,35 млтриэтиламина при -10 С, Спустя 24 чреакционный раствор концентрируют в 2 Овакууме досуха, Остаток растворяют в50 мл метанола. После прибавления0,8 мп (10 ммоль) концентрированнойсоляной кислоты раствор упариваютдосуха в вакууме при 20 С. Эту операцию повторяют три раза с целью перевода гидробромида трипептида в гидрохлорид. Сырой гидрохлорид трипептида растворяют в 50 мл метанола ипредварительно очищают при помощигель-фильтрации через уравновешеннуюколонку с Сефадекс ЛХ, Длядальнейшей очистки концентрируют ввакууме ту фракцию метанола, котораясодержит продукт, поддающийся расщеплению обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина. Остатокрастворяют в 30-ной уксусной кисло"те. Раствор чистят гель-Фильтрациейна уравновешенной 30-ной уксуснойкислотой колонке с Сефадекс"Гф. 4 ОФракцию элюата, содержащую продукт,поддающийся расщеплению трипсином сосвобождением п-нитроанилина, послеприбавления 0,80 мп (10 ммоль) концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием. Получают 3,64 г (58,8от теоретического) аморфного легкого порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В. 5 ОВычислено,Ъ: С 52,38; Н 5,70;Б 18,10( СР 5,73Сл Н БвО С,Найдено,Ъ. "С 52,09; Н 5,83;55Б 18,33 Е СЕ 5,75.Анализ аминокислот дает ожидаетеаминокислоты в правильном соотношении;арг 0,96; гли 1,00; про 0,96.П р и м е р 2, Н-Гли-про-арг-пНА2 ЕЕСС,61,91 г (0,1 моль) полученногопо примеру 1 соединения Б -кбс-,65-гли-про-арг-пЕЕАНС 1 без доступа влаги обрабатывают 300 мл Зн. соляной 65 6кислоты в Ледяной уксусной кислотес перемешиванием в течение 2 ч нрн35 С. Пептидное производное при этомрастворяется с выделением СОд . Реакционный раствор при сильном перемешивании прибавляют, по каплям к 2 л абсолютного эфира, в осадок выпадаетН-гли-про-арг-пНА 2 НСЕ в виде хлопьев, Осадок отделяют и промывают аб,солютным эфиром (4 х 500 мл) с цельюУдаления образовавшегося в качествепродукта расщепления бензилхлоридаи избытка соляной и уксусной кислот.Осадок сушат в вакууме над пластинами БаОН, получают деблокировзнныйпродукт с количественным выходом,Для дальнейшей очистки растворяют высушенный продукт в 900 мп 30-нойуксусной кислоты. Раствор чистят путем гель-фильтрации на уравновешенной30-ной уксусной кислотой колонке сСефадекс Г 15 ф, При этом разделяют элюат уксусной кислоты на двефракции, обе могут быть расщепленыобработкой три.синомс освобождениемп-нитроанилина. Главчая Фракция содержит желаемый продукт, а побочнаяфракция - исходный материал, Послеприбавления 8 мл (0,1 моль) концентрированной соляной кислоты к главнойФракции ее сушат вымораживанием, Получают 43,5 г (83,4 Ъ от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хромагограммев системе растворителей В.Вычислено,%: С 43,77; Н -,.80Б 21,49; С 1 13,60. СН,.Б,О,СЕ,Найдено,%: С 43,38 у Н 5,88 р21,72; С 1 13,41Анализ аминокислот дает ожидаемыеаминокислоты в правильном соотношении:арг 0,95-гли 1,00-про 0,94.П р и м е р 3. Б-2-феннлацетил.-гли-про-арг-пНА НСЕ,2,09 г (4 ммоль) получе 11 йыо согласно примеру 2 н-гли -про-арг-пНА 2 нйрастворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до -10" Сприбавляют 555 мкл (4 ммоль) триэтиламина и непосредственно после зтого1,13 г (4,4 ммоль) и-нитрофениловогоэфира фенилуксусной кислоты(т,пл. 61,5-62 С) . Реакционный продукт перерабатывают дальше, как описано в примере 1.Очистка: гель-Фильтрация на уравновешенной 30-ной уксусной кислотойколонке с Сефадекс Г, фракциюэлюата уксусной кислоты, которая может быть расщеплена обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина,после прибавления 320 мкл (4 ммоль)концентрированной соляной кислотыподвергают сушке вымораживанием.Выход: 1,99 г (82,5 от теоретического) аморфного порошк:,кото-,ый7однороден в тоцкослойной хроматограмме в сиСтеме растворителей В.Вычислено,%: С 53, 77; Н 5, 85; И 18,58; СЕ 5,88Сгл Ны Ыэ О СЕ.Найдено,: С 54,06; Н 5,68;И 18,83 у С 1 5,79,Анализ аминокислот дает ожидаемые аминокислоты в правильном соотношении:арг 0,99 - гли 1,00 - про 0,87. П р и м е р 4. М -3-фенилпропионил-тли-про-арг-пНА НСЕ.2,09 г (4 ммоль) полученного попримеру 2 н-тли-про-арг-пНА2 НС 1растворяют в 25 мл диметилформамида.После охлаждения до -10 С прибавляют555.мкл (4 ммоль) триэтиламина и не-,посредственно после этого 1,19 г(4,4 ммоль) и-нитрофенилового эфира3-фенил-пропионовой кислоты(т.пл .97 -98,5 С), Продукт реакции обрабаты"вают далыде согласно примеру 1.Очистка: гель-фильтрация на уравновешенной 30-ной уксусной кислотой колонке с фсефадекс. Г. ГуФракцию элюата уксусной кислоты, которая может быть расщеплена трипсином с выделением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл (4 ммоль) концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием, Выход:2,06 г (83,5 от теоретического)аморфного Порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме всистеме растворителей В.Вычислено,%: С 54,50; Н 6,04;И 18,16; СЕ 5,75С НИ,О,СЕ,Найдено,: С 54,25; Н 5,98;И 18,29; СЕ 5,63Анализ аминокислот дает ожидаемыеаминокислоты в правильном соотношении:арг 1,02 - гли 1,0 - про 0,98 .П р и м е р 5. И -циклогексилкарбонил-тли-про-арг-пНА НСЕ,2,09 г (4 ммоль) полученного попримеру 2 н-гли-про-арг-пНА 2 НСЕрастворяют в 25 мл диметилформамида.После охлаждения до -10 С прибавляют555 мкл (4 ммоль) триэтиламина и непосредственно после этого 1,10 г(т,пл. 49-50 С) . Продукт реакции перерабатывают дальше согласно примеруОчистка:гель- фильтрация на уравновешенной 30-ной уксусной кислотойколонке с фСефадекс Г. Фракцикэлюата уксусной кислоты, которая может быть расщеплена обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина,после прибавления 320 мкл (4 ммоль)концентрированной соляной кислотыпоорвергают сушке вымораживанием. 73165 8Выход: 1,87 г (78,6 от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограммев системе растворителей В.Вычислено, С 52 р 47 Н б 6И 18,83; СЕ 5,97С р 6 НЗ 9 Ид О Се,Найдено, : С 52, 70; Н б, 72;И 19 03; С 5,83,Анализ аминокислот дает ожидаемыеаминокислоты в правильном соотнадении:арг 0,96 - тли 1,00 - про 0,96.П р и м е р б . И -каприлоил-гли-про-арг-пНА НСЕ .2,09 г (4 ммоль) полученного по15 примеру 2 н-тли-про-арг-пНА2 НСЕрастворяют в 25 мл диметилформамида.После охлаждения до -10 С прибавляют555 мкл (4 ммоль) триэтиламина и непосредственно после этого 1,17 г20 (4,4 ммоль) и-нитрофенилового эфиракаприловой кислоты, Реакционный продукт перерабатывают дальше согласно.примеру 1.Очистка: гель-Фильтрация на урав 25 новешенной 30-ной уксусной кислотойколонке сСефадекс Г, фракциюэлюата уксусной кислоты, которая может быть. расщеплена путем обработкитрипсином е освобождением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл(4 ммоль) концентрированной солянойкислоты подвергают сушке вымораживанием, Выход: 1,99 г (81,4 от теоретического) аморфного порадка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.Вычислено,Ъ: С 53,06; Н 7,09 1Б 18,34 р СЕ 5,80С л Нов Нб Оа С Е,40 Найдено, Ъ: С 52, 84; Н 7, 15;Б 18,58; СЕ 5,73.Анализ аминокислот дает ожидаемяеаминокислоты в правильном соотношении:45 арг 0,95 -гли 1,00 -про 0,99.П р и м е р 7, И -тозил-гли"про-арг-пНА. НСЕ.2,09 г (4 ммоль) полученного попримеру 2 н-гли-про-арг-пЯА 2 НСЕрастворяют в 25 ьд диметилформамида,После охлаждения до -10 С прибавлчот555 мкл (4 ммоль) триэтиламина и непосредственно после этого 840 мг(т.пл. 67-79 С). Продукт реакции перерабатывают дальше согласно примеРУ 1Очистка: тель-Фильтрация на уравновешеннОЙ 30-нОЙ Уксусной кислотойколонке с Сефадекс Г. Фракциюэлюата, содержащую продукт, которыйможет быть расщеплен обработкой трипсином с освобождением п-ннтроанилина,после прибавления 320 мкл (4 ммоль)концентрированной соляной кислотыподвергают сушке вымораживанием. Выход: 2,17 г (84,9 от теоретического)аморфного порошка, который однороденв тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.Вычислено,%: С 48,86; Н 5,521И 17,53 Е Я 5)02 Е С 8 5,55Сг Н ИОЯС 1,Найдено,: С 48,50; Н 5,61 ЕИ 17,73 Е Я 5,191 СЕ 5,49Анализ аминокислот дает ожидаееыеаминокислоты в правильном соотниаениарг 0,99 - гли 1,00 - про 0,93.П р и м е р 8. И -бензолсульфонил-гли-про-арг-пНА НС 1,2,09 г (4 ммоль) полученного попримеру 2 н-гли-про-арг-пНА 2 НСЕрастворяют в 25 мп диметилформамида.После охлаждения до - 10 С прибавляют555 мкл (4 ммоль) триэтиламина и непосредственно после этого 780 мг(4,42 ммоль) хлорангидрида бензолсульфоновой кислоты (т.пл, 16-17 С) .Продукт реакции перерабатывают дальше согласно примеру 1.Очистка;гель-фильтрация на уравновешенной 30-ной уксусной кислотойколонке с 1 Сефадекс. Г Фрак-цию элюата, содержащую продукт, который может быть расщеплен обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина, после прибавления320 мкл (4 ммоль) концентрированнойсоляной кислоты подвергают сушке вымораживанием. Выход: 1,95 г (78 оттеоретического) аморфного порсюка,который однороден в тонкослойнойхроматограмме в системе растворителей В.Вычислено,: С 48,03; Н 5,32;И 17,93 Е Я 5,131 СЕ 5,67С, Нзз ЕЕО ЯС,Найдено,; С 47,69; Н 5,40;ЕЕ 18,11 Е Я 5,06 Е СР 5,61.Анализ аминокислот дает ожидаемыеаминокислоты в правильном соотношении:арг 1,01 - гли 1,00 - про 0,96.П р и м е р 9, ЕЕ -метансульфонил-гли-про- ар г- пЕЕАНС 0,2,09 г (4 ммоль) полученного попримеру 2 н-гли-про-арг-пНА 2 НОрастворяют в 25 мп диметилформамида.После охлаждения до -10 С прибавляют555 мкл (4 ммоль) триэтиламина и непосредственно после этого 345 мкл(4,44 ммоль) хлорангидрида метансульфоновой кислоты. Продукт реакцииперерабатывают дальше согласно примеру 1.Очистка: гель-фильтрация на уравновешенной 30-ной уксусной кислотойколонке с Сефадекс Г, Фракциюэлюата, содержащую продукт, которьФможет быть расщеплен обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина,после прибавления 320 мкл (4 ммоль)концентрированной соляной кислоты,псдг Г ргают с",шке вымри;,жи вани(,м Выход: ),70 г (75,5 от теоретнчес 1:ого) аморфного поЕ)оык, котоя,Й однороден в тонкослойной хроматограммев системе растворителей В,Вычислено, : С 42,66 Е Н 5,55;5 ЕЕ 19,90 Е Я 5,70 Е СР 6,30СНЕЕ, О, СЕ.Найдено, : С 42,88 Е Н 5,63 ЕБ,20,08 Е Я 5,62 Е СЕ 6,21Анализ аминокислот, дает ожидаееюеи, аминокислоты в. правильном соотноше 10нии:арг 0,99 - гли 1,00 - про 0(96.П р и м е р 10, В -2-нафталин 15сульфонил-гли-про" арг-пНА НС 1,2,09 г (4 ммоль) полученного попримеру 2 н-гли-про-арг-пНА 2 НС 1,растворяют в 25 мп диметилформамида.1 После охлаждения до -10 С прибавляют20 555 мкл (4 ммоль) триэтиламина инепосредственно после этого 1,0 г(4,41 ммоль) хлорангидрида нафталин-сульфоновой кислоты (т.пл. 74 -76 С) . Продукт реакции обрабатываютдальше согласно примеру 1.Очистка: гель-Фильтрация черезуравновеаенную 30-ной уксусной кислотой колонку с Сефадекс Г.Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщепить обработкойтрипсином с освобождениемП-нитроанилина, после прибавления 320 мкл(4 ммоль) концентрированной солянойкислоты подвергают сушке вымораживанием. Выход: 1,81 г (66,8 от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.Вычислено,: С 51,59; Н 5,23;И 16,60 Е Я 4,75 Е СЕ 5,2540 СР НУ ИЕ 06 БСЕ.Найдено, : С 51, 88; Н 5, 19;Н 16,75; Я 4,62; СЕ 5)12.,Анализ аминокислот дает ожидаете;аминокислоты в правильном соотнсые 45 нии:арг 1,02 - гли 1,00-про 0,98,П р и м е р 11, И -изобутилоксикарбонил-гли-про-арг-пНА ЕЕСЯ,2,09 г (4 ммоль) полученного по50 примеру 2 н-гли-про-арг-пНа 2 ЕЕСрастворяют в 25 мп диметилформамида.После охлаждения до -10 С прибавляют555 мкл (4 ммоль) тризтиламина и непосредственно после этого 650 мкл55 (5,0 ммоля) изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты. Реакционный продукт перерабатывают дальше согласнопримеру 1..Очистка: гель-фильтрация черезуравновешенную 30-ной уксусной кислотой колонку с Сефадекс Г,Ту фракцию элюата уксусной кислоты,которая может быть расщеплена обработкой трипсином с освобождением и-нитроанилина, после прибавления320 мкл (4 ммоль) концентрированной15 11 673соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием. Выход: 1,71 г (73,1от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.Вычислено,: С 49,27; Н 6,37; 5М 19,15; С 1 6,06Срц Нр ВОС.Найдено,%: С 49,06; Н 6,42;М 19,33; С 1 5,98,Анализ аминокислот дает ожидаетеаминокислоты в правильном соотношении:арг 1,01 - гли 1,00 - про 0,94.П р и м е р 12. М -кбо-гли-про.-арг-НА НС 1а) М -кбо-арг (МО ) -2-ЙА,3,53 г (10 ммоль) хорошо высушенНого кбо-арг(МО) -ОН беэ доступа влаги растворяют в 150 мл смеси тетрагидрофурана и диметилформамида (3; 1), 20После охлаждения до -10 С к растворуприбавляют 1,39 мп (10 ммоль) триэтиламина и потом по каплям в течение 15 мин раствор 1,35 г (10 ммольизобутилового эфира хлормуравьиной 25кислоты в 20 мп тетрагидрофурана,температуру поддерживают при -10 --5 С. К полученному раствору прибавляют по каплям раствор 1,72 г(12 ммоль) Я -нафтиламина в 15 мл 30тетрагидрофурана, причем соблюдаютуказанную температуру, Реакционнуюсмесь оставляют стоять в течение24 ч при комнатной температуре. Пос- .ле отгонки растворителя,в вакууме 35остаток обрабатывают три раза подряддистиллированной водой, три раза5-ным раствором едкого натра иопять три раза дистиллированной водой. После сушки в вакууме растворяют сырой продукт в метаноле и раствор хроматографируют через уравновешенную метанолом колонку с Сефадекс ЛХ. Из одной, Фракции элюатаполучают 3,75 г кристаллического соединения М" -кбо-арг(МО ) -2-НА (78,4от теоретического), т.пл. 173-174,5 С,которое. однородно в тонкослойной хроматограмме в системах растворителейАи БаВычислено,:. С 60,24 у Н 5,481 50М 16,72.еСи Ни МвОНайдено,1 С 60,82; Н 5,63;М 17,48 55б) Н-арг-НА-НС 1 .957 мг (2 ммоль) М" -кбо-арг(МО)- -2 НА помещают в реакционный сосудаппарата Сакакйбараа, куда котйдаенсируют 15 мл высушенного газообразногофтористого водорода. Смесь перемешивают 1 ч при 0 С, при этом отщепляютййтРааааайтнуЮа" група ау"артай 3 Гйаи "аар-бобензоксигруппу. Сконденсированныйгазообразный фтористый водород отгоняют в вакууме из реакционной смеси 165 12и остаток растворяют в диметилформамиде,Дпя перевода производного аминокислоты в солянокислую соль прибавляют 0,5 мл (примерно б ммоль) концентрированной соляной кислоты и раствор упаривают досухаПосле двухкратного повторения этой процедуры остаток растворяют в 50 мл 40-ной уксусной кислоты. Раствор вносят в уравновешенную 30-ной уксусной кислотой колонку с Сефадекс Ги продукт элюируют 30-ной уксусной кислотой. Ту фракцию элюата, которая может быть расщеплена обработкой трипсином с освобождением и-нитроанилина, после прибавления 320 мкл (4 ммоль) концентрированной соляной кислоты, подвергают сушке вымораживанием. Выход: 473 мг (63,5 от тео" ретического) аморфного порсшка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе раСтворителей В.Вычислено,: С 51,62; Н 6,23; М 18 у 81 У СФ 19,05С Н 1 МОСНайдено.,%: С 51,82; Н 6,18; М 17,08," С 1 18,75М -кбо-гли-про-арг-НАНС 1,372 мг (1 ммоль) Н-аргНА НС 1 согласно примеру 1 подвергают взаимодействию с 470 мг (1,1 ммоль) кбо-гли-про-ОпНП, получая соединение (12) . Очистка: гель-Фильтрация на уравновешенной уксусной кислотой колонке с фСефадекс Г, Фракцию элюата, которая может быть расщеплена обработкой трипсйном с освобождением ,б -нафтиламина, после прибавления 80 мкл (1 Ммоль) концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием. Выхода 425 мг (68,1 от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматогРамме в системе растворителей В.Вычислено,а С 59,651 11 6,14 а М .15,71 р Сй 5,68Сн, М,О,СНайдено,: С 60, 11; Н 6,25; М 1 б,07 у Сй 5,59Анализ амйнокислот дает ожидаете аминокислоты"в правильном соотношении:арг 0,98 - гли 1,00 - про 0,97.П р и м е р 13, М "тознл-гли-про-арг-НАНС 1.625 мг (1 ммоль) соединения (пример 12) деблокируют согласно примеру 2 и растворяют в 8 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 С прибавляют 140 мкл (1 ммоль) триэтиламина инепосредственно после этого 210 мг (1,1 ммоль) хлорангидрида итолуолсульфоновой кислоты (т.пл,б 7"69 фс) . Реакционный продукт перераба"тывают дальше по примеру 1.Очистка: гель-фильтрация на уравновешенной 30-ной уксусной кислотой колонке с Сефадекс Г, Ту Фрак(1, 1 ммоль) кбо-гли-про-ОпНП, получая соединение Ы -кбо-гли-про-арге -4-МеО-НАНСЕ . Очистка: гельфильтрация на уравновешенной 30-ной т уксусной кислотой колонке с ф"Сефа-.декс Г1 ф . Ту фракцию злюата уксус 5 ной кислоты, которая может быть расщеплена трипсииом с освобождением 4-метокси-нафтиламина, после прибавления 80 мкл (1 ммоль) концентрированной соляной кислоты сушат выморажива"10 кием. Выход: 493 мг (75,4 от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тоикослойной хроматограмме в системе растворителей В,Вычислено,: С 58,75; Н 6,16; 5 ы 14,901 се 5,72Сзд Нчо Ы Ов СЕНайдено,: С 59,01 у Н 6,101Ы 15,19; СЕ 5,35.Анализ аминокислот дает ожидаетеаминокислоты в правильном соотнсшенииарг 1,02 - гли 1,00 - про 0,95,П р и м е р 15, Ыф -тозил-гли-про-арГ-МеО-НА НСЕ .655 мг (1 ммоль) полученного по 25 примеру 14 соединения ХХЧ деблокируют согласно примеру 2 и растворщот,в 8 мл диметилформамидаПосле охлаждения до -10 С прибавляют 140 мкл(1 ммоль) триэтиламина и непосредственно после этого 210 мг (1,1 ммаль)хлорангидрида п-толуолсульфоново;";кислоты. Продук реал,ни перерабатывают дальше согласно примеру 1,Очистка: гель-фильтрация через уравновешенную 30-ной уксусной кислсяойколонку с Сефадекс Г, Ту фракцию элюата уксусной кислоты, которую(69,0 от теоретического) аморфногопорсшка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В. Формула изобретения цию злюата уксусной кислоты, которуюможно расщепить отработкой трипсиномс освобождением Я -нафтнламина, послприбавления 80 мкл (1 ммоль) концентрированной соляной кислоты подвергаюсушке вымораживанием. Выход: 500 мг(77,6 от теоретического) аморфногопораака, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В,Вычислено,%: С 55,93 у Н 5,95;Ы 15,22 у 8 4,98 у СЕ 5,50СН ЫзО,ВСЕНайдено,: С 56,73 у Н 5,86;Ы 15,481 Я 5,071 СЕ 5,39,Анализ аминокислот дает ожидаемыеаминокислоты в правильном соотисвении:арг 0,95 - гли 1,00 - про 0,96.П р и м е р 14. Ы -кбо-гли-про-арг-МеО-НА НСЕа) Ы" -кбо-арг(ЫО) -4-МеО-НА3,53 г (10 ммоль) кбо-арг(ЫО ) -ОНсоггасно примеру 12, а, подвергаютвзаимодействию с 2,17 г (12,5 ммоль)4-метокси-нафтиламина и перерабатывают, как там указано. Очистка:гель-фильтрация на уравнозваеннойметанолом колонке с фсефадекс ЛХ 20Из одной Фракции элюата попучают3,35 г (65,9 от теоретического) отчасти кристаллического соединенияЫ -кбо-арг(ЫО) -4-Ме 0-2-НА., котороеоднородно в тонкослойной хроматограмме в системах растворителей А и Б,Вычислено,: С 5905; Н 5,55;Ы 16,23;Сы Нд Ы ОНайдено, : С 59, 18; Н 5, 43;Ы 16,49б) Н-арг-МеО-НА 2 НСЕ,1,02 г (2 ммоль) соединения Ы-кбо-арг- (ЫО ) -4 -МеО-НА согласнопримеру 12,б подвергают взаимодействию, получая соединение Н-арг-МеО-НА 2 НСЕ,Очистка: гель-Фильтрация иа уравновешенной 30-ной уксусной кислотойколонке с Сефадекс Г, Ту фракцию элюата уксусной кислоты, котораяможет быть расщеплена обработкойтрипсином с освобождением 4-метокси- .-2-нафтиламина, после прибавления320 мкл (4 ммоль) концентрированнойсоляной кислоты подвергают сушке вымораживанием, Выход: 570 мг (71,0от теоретического) аморфного порсшка,который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.Вычислено,: С 50,88; Н 6,03)Ы 17,45 р СЕ 17,67С 7 Нр ЫОд седНайденО,; С 51,08; Н 5,98;Ы 17, 75; СЕ 17,55в) Ы" -кбо-гли-про-арг-ИеО-НА НСЕ .402 мг (1 ммоль) соединения Нарг,-Ме 0-2-НА2 НСЕ согласно примеру1,б,подвергают. взаимодействию с 470 мг 65 Вычислено,: С 55,22; Н 5,98; Ы 14,54; В 4,76; СЕ 5, 26СНЫ,О, СЕНайдено,: С 55,75; Н 6,01; Ы 14,89; Я 4,59; СЕ 5,16 Анализ аминокислот дает ожидаемые аминокислоты в правильном соотнсянении:арг 0,98 - гли 1,00 - про 0,96 Способ получения пептидов общейформулы15 Составитель В, ВолковаРедактор Т, Орловская Техред О, Андрейко Корректор С. Шекмар Тираж 512 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, ЖРаушская наб., д, 4/5Заказ 3733(55 ФА.Филиал ПППф Патент , г, Ужгород, ул. Проектная, 4 6нильная группа или ацильная группаФормулы3( )где В - алифатический углеводородный остаток с 1-7 атомамиФ углерода, фенилалкиловыйостаток с 1-3 атомами угле"рода в алкильном остатке,циклогексиловый илн алкил-:окси остаток с 1-5 атомамиуглерода в алкильном остат-е ке,В - 4-метокси-нафтиламид, п-нитроанилид, 2-нафтиламид,У - анион минеральной или орга.нической кислот, о т л ичающийся тем, чтосоединение формулыйцаргннин-ОН) НУ(2)где й - блокирующая ( -аминогруппузащитная группа,У . имеет значения, указанныеранее подвергают взаимодействию с изоциаватом ФормулыО = С = М - В (3)где значения Ве указаны в триамидегексаметилфосфорной кислоты в присутствии одного эквивалента третичного органического основания, прикомнатной температуре, в безводнойсреде; полученное при этом соединение ФормулыВаргинин-БН-В )НУ (4)обрабатывают 2 н. НВг в ледяной уксусной или во трифторуксусной, или вбезводной муравьиной кислоте, илигазообразным хлористым Водородом вдибксане, в безводной среде при комнатной температуре," полученный приэтом продукт ФормулыНаргинин-НН-В )2 НУ (5)обрабатывают в диметилформамиде эквивалентный кс(личеством третичного ор ганического основания при комнатнойтемпературе и полученное при этомсоединение формулыН -Е аргинин-НН-ВНУ (6)подвергают взаимодействию с соединением формулыВф -глицин-Е-пролин-й,73165 - 16где В - активная сложноэфирнаяХгруппа;В - имеет значения В, указанные ранее, или алкоксикарбонильная группа, алкильныйостаток которой имеет, по5 крайней мере, один атом во"дорода у-атома углеродаи содержит до 10 атомов углерода, полученное при этомФсоединение формулы10 В -глицин Е-пролин-аргинин-ИН-В )НУ (8)обрабатывают, если В :В"; 2 н.НВ вледяной уксусной или трифторуксусной,или в безводной муравьиной кислоте,)5 или газообразным хлористым водородомв диоксане в безводной среде при ком"натной температуре, и полученное соединениеН -глицин-.Е пролинаргинин-ВН-Ве)2 ну, (9)растворенное в диметилформамиде, приобработке эквивалентным количествомтретичнбго органического основанияпри комнатной температуре переводятВ соединение формулыН -глицин-Е пролин-Е аргинин-ИН-В ) НУ, (10)которое подвергают взаимодействию ссоединением Формулы30 В-В у9(11)где значения й указаны ранее; йфимеет те же значения, что и В, илиозначает хлор или бром, причем, еслиВ - хлор или бром, то третичное органическое основание прменяют в количестве, эквивалентном количеству соединения (11), процесс ведут в диметилформамиде при температуре от -10до 20 С,40Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе1. М, ВойапгИ., М.А. Опс 1 е 111.ф Рер 1 Ые Яуп Жезлов , Уп 1 егвс 1 епсе45 РЬ 11 впегв, 1966, с. 110.2. Там же, с, 163.3. Э. Шредер, К. Любке. Пептиды,ч. 1,М. ф Мир , 1967, с. 112.