Всесоюзная i

О Л И С А Н И Е 352468ИЗОБРЕТЕН ИЯ Сова Советских Социалистических РеспубликК ПАТЕНТУ Зависимый от патента120 9/О Заявлено 17,Х 1,1967 ( 1196860/30-15)52796,66,Приоритет 25.Х 1.196 ВеликобританияКомитет по деламобрвтеиий и открытийри Совете МинистровСССР УДК 631.937:615,779.9 (088.8) 1972, Бюллетень28 убликовано 21 1 Дата опубликования описания 9.Х.1972 Авторыизобретен Иностранцы рнард Морис Лейн и Клод Реймонд Ма(Франция) Иностранная фирма Бритиш Петролеум Компани ЛимитедЗаявитель ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА 2 Изобретение относится к способу получения антибиотиков и антибиотических комплексов.Известен способ получения антибиотического комплекса, содержащего гризео фульвии, состоящий в культивировании микробиологического штамма-продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, в том числе содержащей углеводород, в аэробных условиях с последующим выделением комплекса из культуральной среды.Используемый углеводород содержится преимущественно во фракциях минеральных масел, например нефти, сланцевого или угольного дегтя, Он может представлять собой керосин, газойль смазочные масла, экстракты, полученные при регенерации смазочных масел.Углеводород обычно состоит из смеси углеводородов, содержащих не менее 10 атомов углерода.В качестве источников углерода можно использовать моносахара, молочную сыворотку, мелассу, кукурузную барду, соевую муку, хлопковый жмых и т. д.Источниками азота служат азотнокислый калий, азотнокислый аммоний, аммиак, моче- вина, автолизат и гидролизат дрожжей, соевая мука, хлопковый жмых и т, д,С целью получения комплекса, непосредственно пригодного для использования против фптопатогенных микроорганизмов культивирование продуцента осуществляют в две стадии с использованием в качестве продуцента в первой стадии дрожжей рода СапдЫа, в част ности С. 1 гор 1 са 1 Ь и С, 1 гроутгса, а во второйстадии - плесневых грибов рода Реп 1 сШ 1 цпг, в частности Р. тзео 1 ц 1 цтп-АТСС 11855 и Р. п 1 дг 1 сапз-АТСС 9439, и выделяют антпбиотический комплекс в виде углеводородной 10 фракции, содержащей антибиотик, с добавлением при необходимости в культуральную среду дополнительного количества углеводорода.В первой стадгш соотношение между углеродом и азотом в питательной среде составля ет обычно не меньше 20: 1, преимущественно10: 1 а во второй стадии - не меньше 80: 1, рН на первой стадии 4,5 - 5,0, на второй 5 - 8,Используемый углеводород выделяется вместе с микроорганизмом первоц и второй ста дии таким образом, что микроорганизм на первой стадии способен метаболизировать только лишь часть углеводорода, а на второй стадии способен метаболпзировать по меньшей мере ту часть углеводорода, которая не была мега болпзпрована ранее.Антибиотик растворяется в углеводородеиспользуемом в качестве растворителя, способного растворить более 1,иг культуры на 1 л раствора, преимущественно 0,001 - 5 г/л и 30 большей частью 0,5 г/,г.0,1 0,01 0,01 100 лл Таблица40 Сухой весмицелия,Антибиотикф, лкг регенернрованНомерпримераный йзгазойля регенернро ванный изводной фазы 2550 1740 1632 бб 53 105 17,5 11,1 24,7 50 55 60 65 Потребление углеводорода микроорганизмом при определенных условиях реакции может быть таким, что незначительное количество остаточного углеводорода не сможет растворить гризеофульвин, который при этих условиях в значительных количествах присутствует в водной фазе. Для перевода всего гризеофульвина в углеводородную фазу желательно добавить в культивируемый продукт углеводородсодержащую среду, которая может быть той же самой или отличаться от уже использованного углеводорода.Обычно гризеофульвин переходит в углеводородсодержащую фазу, а микроорганизм - в водную. Для выделения используют метод фильтрования и/или центрифугирования,Все стадии могут быть проведены одновременно и непрерывно,Состав, содержащий раствор гризеофульвина в углеводороде, пригоден для использования в сельском хозяйстве, в частности в качестве соматического антибиотика, в концентрации 0,1 - 0,4 г/л, преимущественно 0,25 г/л. Его можно использовать для обработки почвы, растений, деревьев или семян при борьбе с ЛИегпапа, Непппйозрог 1 цгп, Рцзагцгп, О а 1 цгп. П р и м е р 1. В колбу емкостью 1 л, оборудованную системой аэрации, высевают 500 мл смеси субстрата с питательной средой, содержащей (в г):Кукурузная вытяжка 48Глюкоза 50Фосфорнокислый калий 4 Хлористый натрий 1 Смесь разбавляют 1000 ч. мягкой воды, содержащей микроэлементы.Соотношение между углеродом и азотом в смеси 20: 1. В 48 г кукурузной вытяжки содержится 4 г азота.К этой смеси добавляют 50 лл суспензии спор штамма Р. дг 1 зео 1 ц 1 мцгп-ЛТСС 1885 и выдерживают при 26 С и рН 4,5 - 5 при аэрации культуры со скоростью 200 об 1 час,Через трое суток мицелий отфильтровывают на воронке Бюхнера и промывают равным объемом среды, состав которой указан ниже,Мицелий высевают в колбу емкостью 1 л ссистемой аэрации, содержащей 500 лил смесисубстрата с питательной средой, содержащей(в г):Лзотнокислый натрий 2Газойль 200Фосфорнокислый калий 4Хлористый калий 1Сернокислый магний 0,5Раствор микроэлементов 5 ллВодопроводная вода 1000 млОтношение углерода к азоту в смеси 80; 1.Раствор микроэлементов содержит (в г):Сернокислое железо 0,1Сернокислая медь 0,015 15 20 25 30 35 Сернокислый цинкСернокислый марганецМолибденовокислый калийМинеральная вода Лэрацию проводят со скоростью 600 обчас. Вначале добавляют 50 г газойля и затем через 1 сутки 16 г, через 2 суток 16 г, через 3 суток 16 г и через 4 суток 50 г газойля,С целью регенерации неметаболизированного газойля и биомассы, культуру фильтруют на воронке Бюхнера через последующие четверо суток, получая фильтрат, состоящий из водной фазы и газойля, и остаток, содержащий мицелий.Мицелий сразу же дважды обрабатывают гексаном и сушат при 90 С. Из фильтрата выделяют газойль с растворенным гризеофульвином,Содержание антибиотика в неметаболизированном газойле определяют биологическим способом по Гцзапип сцгпогцтп. Содержание антибиотика в мицелии определяют следующим способом.Мицелий сушат при 50 С, взвешивают и измельчают. К 1 г мицелия добавляют 10 лл бутилацетата и перемешивают 1 час при 50 С. После фильтрования на воронке Бюхнера фильтрат концентрируют в вакууме при 50 С, остаток обрабатывают гексаном и нерастворимую фракцию растворяют в ацетоне в пропорции 1 лл ацетона на 1 г остатка смеси. Эту смесь снова фильтруют на воронке Бюхнера и содержание гризеофульвина в ацетонном растворе измеряют спектрофотометрически в УФ-свете при 288 ллк, Результаты, полученные для Р. дгзео 1 цх цгп, представлены в табл, 1. Установлено, что мицелий почти свободен от антнбиотнка. П р и м е р 2. Повторяют способ обработки,описанный в примере 1, но вместо 50 г глюкозы в первой стадии обработки культуры вкачестве источника углерода используют 150 ггазойля,Смесь разбавляют 1000 ч. мягкой воды, содержащей микроэлементы, Результаты представлены в табл, 1.П р и м е р 3, Повторяют способ, описанныйв примере 2, но вместо 150 г газойля в первойстадии обработки культуры используют 25 г/лтяжелых жирных кислот, состав которых приведен в табл. 2,НасыщенньшНасыщегшьшНасыщенныйНенасьгщенныйНасыщенньшНенасыщенныйНасыщенныйНенасыщенный Таблица 3 Антибиотик. лг Номерпримера регенерированный нз водной фазырегенерированный из газойля 384 768 1088 4 5 6 256 60 65 Тяжелые жирные кислоты получают при гидролизе дрожжей, выращенных на фракции нефти, в 10%-ном спиртовом растворе едкого кали в течение 3 час при температуре кипения. После этого полученую смесь обрабатывают гетролейным эфиром до восстановления пены тяжелых кислот с последующим окислением и промыванием водой. Остаток представляет собой фракцицо тяжелых жирных кислот.Результаты опыта представлены в табл. 1.В примерах 2 - 6, как и в примере 1, в качестве микрооргашгзма цспользугот 1 д. дг 1 веои 1- чцгп.Г 1 р и м е р 4, Для получения культуры мпцелия повторяют первую стадию способа по примеру 1, но культуру выдерживают ца кукурузцо-глюкозном субстрате в течение девяти суток при аэрации со скоростью 200 об/час в течение трех суток и прц аэрации со скоростью 400 обгчас в последующие дни.Затем культуру смешивают с 20%-цым газойлем и выделяют антибиотик, как в примере 1.Результаты опыта представлены в табл. 3.П р и м е р 5. Повторяют способ по примеру 4, но культуру выдерживают в гечепие семи суток ца кукурузно-глюкозном субстрате и газойль перемешивают с культурой в течение бб час.Полученные результаты приведены в табл,3. Пример 6, Повторяют способ по примеру 5, но в культуру добавляют газойль и выделяют культуру в три стадии. Сначала перемешивают культуру 1 час в 20%-ном газойле с последующей регенерацией газойля, затем 1 час в 20%-цом свежем газойле с последуошей регец"рацией газойля и, наконец, 2 час в 20%-ном свежезг газойле с последующей регенерацией газойля. 15 20 25 30 35 40 45 50 В целом это соответствует перемешивашпо 1 л культуры с 600 лг,г газойля в течение 4 час.Полученные результаты представлены в табл. 3.П р и м е р 7. В фермецтер-мешалку емкостью 15 г заливают 10 л водной минеральной срелы, содержащей (в вес. %):Фосфат натрцятрехосновный 3,4лористыш калий 0,6 Сернистый магний 0,3 Сернистый аммоний 2,5 Состав разбавляют 1000 ч. мягкой воды, содержащей микроэлементы,В ферментер дополнительно вносят несколь ко миллионов елниц дрожжевого экстракта, а затем 50 г штамма культуры С. 1 гор 1 са 1 в в виде волцоц пены, содержащей 20 вес, % сухого материала и 150 г тяжелого газойля, содержащего 20 вес. % углеводородов парафинового ряда.Температура культуры 30+1 С, рН 4. Условия аэрации ц перемешцвацця поддерживаются такцмц, что ь 1 лин в 1,г среды вводят 3 льноль кислорода. Растворение аммиака контролируют автоматическим рН-метром.Когда плотность ячеек цены достигает 4 г/л, скорость аэрации ферментера составляет 0,1 об/час. К эгому времени содержание газойля в фермецтере позышается до 120 г/л. Обработанную среду удаляют цз фермецтера, лобаьляют (в г/л): 2 азотцокцслого калия, 4 фосфорцокцслого калия, 1 хлористого калия и 150 газойля и к 1 л смеси примешцвают гпокулят, состоящий цз Р. дг 1 вео 1 ц 1 ыцгп, выращенного на кукурузно-глюкозцом экстракте, как указано в примере 1. Эту смесь перемешивают с аэраццей четверо суток, За это врегея гроисхолит регенерация газойля. Оц содержит 2 г/,г антибиотика,Для получения дрожжевого экстракта к верхцсц фазе, полученной после удалешгя 65% -цой отработанной среды и замены ее водопроводной водой, добавляют 0,5 г/л неионцого моющего средства НИ: ц в результате конденсации получают продукт, который солержцт 1 г-лоль лаурццового спирта ц 8,75 г-лоль окиси этилена, После центрцфугцровацця регецерцруют (в г/л);Отработанная минеральная вола 839 Неметаболцзцрованный газойль 112 Пастообразцая масса микроорганизма 49 Пастообразцуо массу микроорганизма промывают волоц прц комнатной температуре и цсцтрцфугцруют. Полученная пастообразная .; асса лрожжей солержцт 65 - 70% воды.3 ля получешя пастообразцой массы дрожке.1, солеркащег 50 вес. % сухих дрожжей и 50 вес. % волы, цз цее удаляют избыток воды.После этого сырые дрожжи вносят пол давлецием в экстрактор, представляющий собой фцльтрозальцый барабан, вращающийся на,".одержание азота в сухихдрожжахСодержание всех лиьидов всухих дрожжах 0,2 13,8 Составитель Ч. Дранишников Редактор Т. Шарганова Техред Л. Евдонов Корректор Л. БадыламаЗаказ 3224/16 Изд. М 1330 Тираж 400 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретении и открыггпй при Совете Министров СССРМосква, Ж, Раушская наб., д. 4 5 Типография, пр. Сапунова, 2 горизонтальной оси. В сырые дрожжи добавляют смесь (при соотношении между смесью и сухими дрожжами 8: 1), состоящую из 50% гексана и 50% изопропанола. Дрожжи с водой и растворитель выдерживают 30,вин при 50 С, затем удаляют растворитель, содержащий основную часть загрязняющих веществ.Оставшуюся часть сырых дрожжей снова обрабатывают смесью растворителей при 50 С в течение 30 мин, используя 1 ч. воды, 4 ч, смеси, состоящей из 50% гексана и 50% изопропанола, на 1 ч, сухих дрожжей, После удаления экстракта, содержащего загрязнения, остаток обраоатывают 2 ч, смеси, содержащей 80% и-гексана и 20% изопропанола.Смесь выдерживают 10 лтин при 50 С, удаляют из нее под давлением растворитель, повторяя процесс очистки четыре раза.Дрожжевой продукт высушивают перегретым паром.Результаты анализа дрожжей до и после регенерации смесью растворителей представлены в табл. 4,Полученный дрожжевой продукт, свободный от загрязнений, может быть использован в качестве кормового материала. Характеристика используемого в опытахгазойля:Уд. вес. при 60 С 0,8698Л 20 1,4835Температура помутнения, С +16 Температура застывания, С +15 Содержание серы, % 1,67 Содержание н-парафина, % 14,7 10 Предмет изобретения1, Способ получения антибиотического комплекса, содержащего гризеофульвин, включающий культивирование микробиологического штамма-продуцента на питательной среде, со держащей источники углерода, азота и минеральных солей, в том, числе содержащей углеводород, в аэробных условиях и последующее выделение апти биотического комплекса из культуральной среды, отличающийся тем, что, 20 с целью получения комплекса, непосредственно пригодного для использования против фитопатогенпых микроорганизмов, культивирование продуцента осуществляют в две стадии с использованием в качестве продуцента в 25 первой стадии дрожжей рода СапдЫа, в частности С, 1 горсав и С. 1 ро 1 у 11 са, и во второй стадии - плесневых грибов рода Репс 111 шгп, в частности Р. дг 1 зеоЪ 1 чцгп-ЛТСС 11885 и Р. иогсапв-ЛТСС 9439, а выделение антиби отического комплекса проводят в виде углеводородной фракции, содержащей антибиотик, с добавлением при необходимости в культуральную среду дополнительного количества углеводорода.35 2. Способ по и. 1, отлачаюирйся тем, что соотношение между углеродом и азотом в питательной среде составляет в первой стадии культивирования не менее 20: 1, а во второй стадии культивирования не менее 80: 1.