Термотолерантный штамм дрожжей, используемый для сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве этилового спирта и способ сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве этилового спирта

СООЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИН 9) О) 2 Р 7/ 5 С 12 И 15 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ащего сырь ого спирта оизводстве этило(22) (46) (72) Т.ф. С.В. ская С,И. (71) ьева,ен ов ьОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ 361065928-1318.05.8307. 10.84. Бюл, У 37Б.А. Устинникор, Л.А. ВоробКорсакова, Н.С. Сухорукова,Пыхова, Г,В, Смотрич, М,Т, ЯЛ.И. Воронова, Е.А, ДвадцаИбрагимова и Н.А, КрамарскиВсесоюзный научно-исследова ский институт продуктов брожения(56) 1. Авторское свидетельство СССРпо заявке3410974, 18,03.82.2. Маринченко В.А., Смирнов В.А.,Устинников Б.А., и др. Технологияспирта. М "Легкая и пищевая промышленность", 1981, с; 4163. Авторское свидетельство СССР9 566872, кл. С 12 С 11/08, 1976.4. Регламент производства спиртаиэ крахмалистого сырья. Часть 1. М.,Минпищепром СССР, Всесоюзный научноисследовательский институт продуктовброжения, 1979, с.81-85,(54) ТЕРМОТОЛЕРАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙЗАССНАКОМУСЕБ СЕКЕЧ 181 АЕ РАСА ВП,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ СБРАЖИВАНИЯ КРАХМАЛСОДЕРЖАШЕГО СЫРЬЯ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕЭТИЛОВОГО СПИРТА, И СПОСОБ СБРАЖИВАНИЯ КРАХМАЛСОДЕРЖАИ 1 ЕГО СЫРЬЯ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ЭТИЛОВОГО СПИРТА.(57) 1. Термотолерантный штамм дрожжей БассЬагошусез сегеч).зае расаВП (коллекция культур промышленныхмикроорганизмов Всесоюзного научноисследовательского института генетики и селекции микроорганизмов, коллекционный номер ЦМПМ У), используемый для сбраживания крахмалсодер. -2. Способ сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве этилового спирта, предусматривающий приготовление посевной культуры, подготовку питательной среды путем смешивания крахмалсодержащего сырья с необходимыми для дрожжей солями - карбамидом и диаммонийфосфатом, дрожжегенерацию, осахаривание и передачу дрожжевой культуры из сусла концентрацией 17-197 сухих веществ в головной ферментер батареи с последовательным перемещением непрерывно-поточным методом и притоком осахаренного сусла, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью обеспечения стерильности процесса, ускорения процесса сбраживания путем поддержания постоянным оптимального для размножения дрожжей соотношения азота к сбраживаемым углеводам, в качестве посевной культуры используют термотолерантный штаммдрожжей Басспагошусез сегечзае расаВП, в процессе дрожжегенерации осуществляют адаптацию этого штамма кусловиям сбраживания путем трехступенчатого пересева его на осахаренное сусло концентрацией 17-19 Х сухихвеществ. с постепенным повышением температуры от 22 до 28 С, от 28 до 30 Сот 30 до 32 С, при этом карбамид разделяют на две части в соотношении1:4, большую из которых вводят в осахаренное сусло перед первой ступеньюпересева, а меньшую - на лаг-фазупроцесса брожения совместно с притоком осахаренного сусла.1 1117319 3Изобретение относится к спиртовойпромышленности и представляет собойтермотолерантный штамм дрожжей БассЬагошусея сегечяае раса ВП длясбраживания крахмалсодержащего сырьяв спиртовой отрасли и способ сбраживания крахмалсодержащего сырья,Известен термотолерантный штаммдрожжей ЯассЬагошусея сегечядае расаК, используемый для обслуживания 10крахмалсодержащего сырья при производстве спирта 1,Недостатком этого штамма являетсяего неспособность сбраживать высококонцентрированное сусло (17-19 СВ). 15Наиболее близким по техническойсущности к предлагаемому являетсяштамм БассЬагошусея сегечяае расаХП, сбраживающий высококонцентрированное сусло 21,20Недостатком известного штамма яв"ляется то, что он не термотолерантОньп 3 и уже при температуре выше 32 Спроисходит автолиз, что ведет к инфицированию среды посторонними микро организмами и к потерям спирта.Известны способы сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта, предусматривающие введение дрожжей и сбраживание зерно-кар- З 0, тофельного сусла непрерывно-поточнымметодом 3 . Наиболее близким техническим решением к предлагаемому является способ сбраживания крахмалсодержащего 35 сырья при производстве этилового спирта, предусматривающий приготовление посевной культуры, подготовку питательной среды лутем смешивания крахмалсодержащего сырья с необходи мыми для дрожжей солями - карбамидом и диаммонийфосфатом, дрожжегенерацию, осахаривание и передачу дрожжевой культуры и сусла концентрацией 17- 19 СВ в головной ферментер батареи 45 с последовательным перемещением непрерывно-поточным методом и притоком оса" харенного сусла 4.Недостатком известного способа является то, что процесс брожения 50 протекает лри температуре не вьппе 30 С, при повышении же температуры происходит значительный автолиз дрокжевых клеток и инфицирование среды. Так как нарушается в процессе броже ння оптимальное сбалансированное пи" тание по азоту и углеводам, дрожжи теряют свою активность, что в сочетании с инфицированием среды приводит к значительным потерям в выходе спирта. Уже после 48 ч сбраживания нет резервов для удлинения процесса и получения дополнительного выхода спирта. Наступает инфицирование среды и потеря дрожжами бродильной ак-. тивности.Целью изобретения является получение термотолерантного штамма дрожжей, способного сбраживать высоко- концентрированное сусло при повьппенных температурах, обеспечение стерильности процесса, ускорение процесса сбраживания путем подцержания постоянным оптимального для размножения дрожжей соотношения азота к сбраживаемым углеводам.Предлагаемый штамм вьщелен из производственных дрожжей и адаптирован к высоким концентрациям сухих веществ в суслеСелекция проводилась в два этапа, Первый этап заключался в вьщелении расы дрожжей из производства, способной сбраживать сырье лри повьппенной температуре (34-36 С). Для этого приоменяемая на заводе культура дрожжей рассеивалась в виде колоний на сусло- агар и выращивалась при 34-36 С. Коо лонии, отличающиеся от исходной расы дрожжей, проверялись на способность сбраживать углеводы.На втором этапе селекции был применен метод адаптации термотолерантной расы к высоким концентрациям сухих веществ. Путем еженедельного пересева термотолерантной расы из среды с повышенной концентрацией сухих веществ и рассева дрожжей в виде колоний на сусло-агар была отобрана раса, отличительной чертой которой была способность при 34-36 С сбражио вать сусло с высокой концентрацией сухих веществ (до 20 ).Штамм хранится в коллекции музея культур промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции, коллекционный номер У,Предлагаемый штамм дрожжейЯассйагошусея сегечяхае раса ВП имеет следующие морфологические и культуральные признаки. Морфологические признаки,Дрожжевые клетки овальной или яйцевидной формы. Размер клеток 7,5 х 5,9 мкм; Размножение почкованием, Форма дрож 1117319 4жевых клеток выращенных на суслоО агаре в течение 26-28 ч при 32-34 С, яйцевидная, овальная, редко встречаются клетки вытянутой формы.Гигантская колония 10-суточной 20 Ф ЭОтношение к источникам азота. Хорошо ассимилирует мочевину, пептон,дрожжевой автолизат, азотнокислый ихлористый аммоний, азотнокислый калий, кальций, натрий.Не потребляет сернокислый аммоний,факультативный анаэроб,ля достижения поставленной целипо способу сбраживания крахмалсодержащего сырья при производстве этилового спирта, предусматривающему приготовление посевной культуры, подготовку питательной среды путем смешивания крахмалсодержащего сырья с необходимыми для дрожжей солями - карбамидом и диаммонийфосфатом, дрожжегенерацию, осахаривание и передачудрожжевой культуры и сусла концентрацией 17-19% сухих веществ в головнои ферментер батареи с последовательным перемещением непрерывно-поточнымметодом и притоком осахаренного сускультуры на сусло-агаре.Форма колонии: круглая,Размер колонии: 26-28 мм в диаметре.Характер края: крупнолопастной с радиальной исчерченностью 1 ОПоверхность: тусклая.,В центре колонии выпуклый валик неправильной формы с морщинистой поверхностью,Цвет колонии: белый с кремоватой серединой.Профиль колонии: в центре выпуклый.Штрих на сусло-агаре,Рост: мощный, плотный.Характеркрая: мелкофестончатый.Профиль: выпукльп.Цвет, штриха - тусклобелый.Рост по уходу в сусло-агар,Рост по длине укола, утолщающийсякверху. 25Форма укола; бугристая,Разжижения не наблюдается.Питательная среда пронизана пузырьками газа.Физиологические признаки. З 0Оптимум температуры роста 34/36 С.Отношение к источникам углерода.Усваивает глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу. Слабо ассимилируетксилозу, арабинозу, Не усваивает крахмал декстрины мелибиозу. ла, в качестве посевной культуры используют термотолерантный штамм дрожжей БассЬаготпуез сегечпае раса ВП,а в процессе дрожжегенерации осуществляют адаптацию этого штамма к усло-.виям сбраживания путем трехступенчатого пересева его на осахаренное сусло концентрацией 17-19% сухих веществс постепенным повьппением температурыот 22 до 28 С, от 28 до 30 С и от30 до 32 С, при этом карбамид разде 0ляют на две части в соотношении 1:4,большую из которых вводят в осахаренное сусло перед первой ступенью пересева, а меньшую - на лаг-фазу процесса брожения совместно с притоком осахаренного сусла,Предлагаемьп способ осуществляетсяследующим. способом.Культуру БассЬагошусез сегечдздаераса ВП выращивают на сусло-агарев пробирках, хранят культуру, затемпересевают на свежую питательную среду - сусло-агар.Затем осуществляют разведение чистой культуры путем ее последовательного пересева.Полученные засевные дрожжи адаптируют к повьппенной температуре сбраживания, осуществляя последовательныйпересев в три ступени на осахаренноевысококонцентрированное Сусло с постепенным повышением температуры от22 до 28 С, от 28 до 30 С и от 30до 32 С. Карбамид разделяют на две части в соотношении 1:4 и вводят соответственно в осахаренное сусло перед первой ступенью адаптации и на лагфазу в процессе брожения совместно с притоком дрожжей и осахаренного сусла.Соотношение усвояемого азота к сбраживаемым углеводам на протяжении всего процесса брожения поддерживают равным 1:200.Брожение ведут непрерывно-поточным методом.ФП р и м е р 1. Культуру БассЬ.сегечзае раса ВП выращивают насусло-агаре с содержанием 7% СВ впробирках при 32 С в течение 24 ч,оХранят культуру при 6 С в течениеа1,5 мес. По истечении указанногосрока для сохранения бродильной активности культуру пересеивают насвежую питательную среду - сусло-агар.11173Затем осуществляют разведение .чистой культуры путем последовательного пересева из пробирки с культурой. в колбу, содержащую 0,5 л стерильного сусла. Сусло приготавливается из из мельченного солода (на 1 кг солода расходуется О, л воды), осахаривается при 58 С в течение 2 ч. Концентрация его должна составлять 120 по сахарометру, 1 ОКолбу с суслом и дрожжами помещают в термостат при 30 С. Через 20 ч бродящее дрожжевое сусло переливают в бутыль с 5 л стерильного такого же сусла, подкисленного до 0,80 Д. Бутыль 15 с суслом помещают в термостат 30 Со при отброде, равном 50 по сахарометру, перелцвдют содержимое в маточник с 5 дан сусла концентрацией 10 по сахарометру, подкисленное до 0,8 о, 20Для разведения дрожжей в маточнике используют цефильтрованное сусло, приготовленное следующим образом.Для приготовления 1 дал дрожжевого с.уела расходуется 1,3 кг ржаной . 25 муки и 1,9 кг измельченного зеленого солода, Муку смешивают с водой при 30 С. Смесь выдерживают при 90 Со оо в течение часа, расхолаживают до 60 С, после чс го здливается дробленый со лод, Осдхдрцвацие продолжается 1 ч при 58 С и 1,5 ч при 65 С, Затем сусоло выдерживается при 80 С в течениео 30 миц, охлаждается до 50 С и подкисляется до 0,75 серной кислотой.Здсевцые дрожжи из бутыли в маточО цпк задаются в объеме 107 при 30 С, Из мдточника дрожжи передают для последующего размножения в дрожжанки.Характеристика зрелых дрожжей представлена в табл. 1, динамика цакоплеция дрохокевых клеток - в табл. 2,П р и м е р 2. Полученные по примеру 1 засевные дрожжи адаптируют к повышенной температуре сбраживацця, осуществляя пересев в три стуцецп цд сусло, приготовленное из измельченной пшеницы, Для получения сусла пшецпцу измельчают, смешивают с водой в соотношении 1:2,8 до концентрации 181 СВ, осахаривают смесью солодов в течение 2 ч. В осахдреццое сусло задают диаммоццйфосфдт в количестве 150 г и карба 55 мцд в количестве 560 г на 1 м /сусла,5 перемешивают, пастеризуют в течениео20 цсц при 80 С, подкисляют до р 3,6-.,Я, охлдждают до температуры 19 Ь1-й стадии адаптации 22 оС, засеваютна эту среду дрожжи в количестве 1 Огк объему осахаренного сусла и сбраживают в течение 18 ч, поддерживаяотемпературу брожения до 28 С, Затемвновь аналогичным образом готовятсусло, вводят дрожжи в количестве107. к объему сусла и сбраживают в течение 16 ч , поддерживая температуру28-30 С (за счет тепла, выделяемогопри сбраживании). Аналогично осуществляют 3-ю стадию адаптации в течение16 ч, поддерживая температуру 30-32 С.оОтношение азота к углеводам устанавливают оптимальным для дрожжей,равным 1:200, при введении карбамидана стадии дрожжегенерации.С 3-ей стадии адаптированные кпроизводственным условиям дрожжи пересевают в три дрожжацки на сусло,приготовленное указанным способом,Через 1 ч ч сбраживация производственные дрожжи из 3-х дрожжанок передают в головной Ферментер батареи.Сбраживание осуществляют в Ферментере емкостью 100 м при скорости притока сусла 12 м в час и подачи дрож"жей - 30 м совместно с карбамидом,который задают в количестве 1 цО гна 1 м сусла для поддержания соотношения азота к сбраживаемым углеводамравным, как уже доказывалось, 1:200.Температура подаваемого сусла на брожение 30 С. Брожение ведут непрерывоно-поточным методом в течение 60 чпри температуре на стадии главногоброжения до 38 С. Выход спирта равен65,5 дал из 1 т крахмала,Технологические показатели зрелойбражки представлены в табл. 3.Осуществление процесса достигаетсяиспользованием термотолерацтного штам-ма дрожжей и введением карбамида вдва приема - на стадии дрожжегенерации и в начальной стадии процессаброжения,При использовании термотолерантцого штамма сохраняется жизнедеятельность дрожжей при высоких температурах. В этом случае це происходит значительный автолиз дрожжевых клеток,сохраняется их бродильная активностьи тем самым ингибируется развитиепосторонней микрофлоры,Этот эффект направленный на сохранение жизнедеятельности и высокойактивности дрожжей, еще более усиливается введением и поддержанием сба173 Таблица 1 Контроль Время созревания дрожжевыхклеток, ч Процент мертвых клеток Процент почкующихся клеток Количествоклеток,мпн/мл Температураброжения,Температураскладки,Начальная концентрация дрожжевогосусла, 7 11,0 0,0 173 22 27 24 18,8 24 19,6 0,8 159 21 26 17,4 166 28,5 0,4 22 27 24 18, 1 Ередние результаты 19,7 0,4 22 24 18,1 лансированного питания по азоту и углеводам. Азот необходим для создания,белков, дрожжевой клетки, включаяструктурные белки, входящие в составоболочки клетки, оболочки спор, иструктурные элементы внутренних частиц клетки, и для создания всей ферментной системы клетки.Углеводы необходимы для дыханияклетки, биосинтеэа белков в тех случаях, когда нет необходимых аминокислот.Из карбамида дрожжей образуют одиниз необходимых для их развития витаминов - биотин, 15Максимально возможная скорость размножения дрожжей достигается лишь приобязательной и строгой сбалансированности процессов анаболизма и катаболиэма. Скорость размножения дрожжей на 2 Обогатых питательных средах в значительной степени зависит от сбалансированного источника питания,Внутриклеточная концентрация азотистых и углеводных соединений возрастает в лаг-период весьма существенно,поэтому важно ввести источник азотаименно в две фазы на стадии активно. го размножения дрожжей и в периодлаг-фазы, когда молодые клетки ужепотребили часть питательных веществи его надо восполнить, чтобы соотно 19 8шение азота к углеводу было постоянным и равным 1;200,После лаг-фазы жизнедеятельностьдрожжей протекает в постоянных установившихся условиях, начинается процесс биосинтеза спирта и это соотношение уже остается постоянным.Если давать карбамид лишь на стаФдии дрожжегенерации, то это привЕдетк увеличению в среде источника азотаи энергии при отсутствии сбалансированности по углеводу, что отрицательно влияет на физиологическое состояние клетки. Оптимальным являетсясоотношение 1:200, так как выше илиниже этих пределов неиспользованнаяна процессы размножения клеток энергия рассеивается в виде тепла и аккумулируется в запасных и недоокисленных продуктах метаболизма,Преимущества предлагаемого технического решения по сравнению с известным представлены в табл, 4.Таким образом, предлагаемые штамм и способ позволяют сбраживать высоко- концентрированное сусло при повышенных температурах, обеспечить стерильность процесса, ускорить процесс сбраживания путем поддержания постоянным соотношения азота к сбраживаемым углеводам.1117319 Продолжение табл, 1 Процентпочкующихсяклеток Процентмертвыхклеток Время созреваниядрожжевыхклеток,ч 42,6 0,0 28 18,4 0,9 37,5 110 14 30 27 0,6 71,7 98 14 32 28 0,6 50,6 113 14 28 17,9 Т а б л и ц а 2 Опыт Контроль . Процентпочкующихсяклеток Продол- жительПродол- жительПроцентмертвыхклеток Общее колиОбщее колиДрож- жанка Дрож- жанка ность честчество ность выращивания выращивания,ч дрож- жевых во дрож- жевых клеток млн/мл клеток,млн/мл 39 63,0 47 61,7 50 74,0 70 57., 0 90 55,1 108 57,5 112 58,9 125 70,0 127 75,0 52 54,560,5 34,763,5 35,188,0 37,5122,0 42,6 . 0,1 10 10 12 14 16 16 18 64,3 137 20 37,2 151 22 173 Начальнаяконцентрация дрожжевогосусла, Е Температураскладки,фС Температураброжения,Средние результаты 12,7 0,4 Количествоклеток,млн/мл Процент Процент почку- мертвых ющихся клеток клеток14 11173 19 Таблица 4 Стерильность процесса Способ сбраживания Времяебраживания, ч Выход спирта 48 ч 64,7 дал/ткрахмала Предлагаемый Процесс протекает в стерильных условиях при 38 С, так как исопользуется термотолерантный штамм, исключающий процесс автолиза, поддерживая оптимальное соотношение азота к углеводу благодаря двухступенчатой задаче карбамида.ч 60 ч 65,5 дал/ткрахмала 48 ч 64,7 дал/ткрахмала Известный Процесс протекает при температуре не выше 30 С, Повышениетемпературы приводит к инфицированию, так как дрожжи не термотолерантны и подвергаютсяавтолизу Составитель Л. Пашинина Редактор Н. Егорова Техред А,Бабинец Корректор А. ОбручарЗаказ 7152/17 Тирах 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 П р и м е ч а н и е. Дальнейшее увеличение времени сбраживания невозможно, так как идет нарастание кислотности и потеря спирта. Нет резервов для увеличения выхода.