Способ получения антивирусного препарата из дрожжей

СОЮЗ СОВЕТСИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1659053 А я)5 А 61 К 35/76 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ(21) 4405765 (22) 07.04.88 (46) 30,06,91 (71) Институ им,Д,К,Забо (72) А.Г.Ков на И А,А.Ба (53) 577.15.0 Изобретение относи получения биологически тов для растениеводства я к технологии ивных препара-. животноводства.аеай Ос (О ,0 О АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ,Бюл, %24т микробиологии и вирусологии лотногоаленко, А,Д.Бобырь, Т.Д.Грабиркалова72:632,981(088,8) 6) Авторское свидетельство СССРМ 687120, кл, С 12 Р 1/02, 1979,Авторское свидетельство СССРЬ 302368, кл. С 12 Р 1/02, 1971.4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИВИРУСОГО ПРЕПАРАТА ИЗ ДРОЖЖЕЙ Цель изобретения - упрощение технологического процесса получения антивирусного препарата из дрожжей и повышение выхода биомассы продукта.Цель достигается тем, что вместо рибонуклеазы и фенола для очистки препарата используют органическую кислоту, предпочтительно уксусную, выполняющую одновременно и функцию активного экстрагента. Кислота применяется в концентрации 5-8, не снижающей активности, получаемого препарата,но обеспечивающей его высокий выход и хорошую очистку от примесей. По предлагаемому способу в качестве исходного сырья можно использовать не только дрожжевую биомассу, выращенную в лабораторных ус(57) Изобретение относится к технологии получения биологически активных препаратов. Цель изобретения - упрощение технологического процесса получения антивирусного препарата из дрожжей и повышение выхода биомассы продукта, Для этого отделенные от культуральной жидкости и высушенные клетки гомогенизируют, растворимые вещества из гомогената экатрагируют 5-6-ной укСусной кислотой, центрифугируют и осадок отбрасывают, Экстракт упаривают в вакууме при 50 С и охлаждают, целевой продукт из концентрата осаждают двумя объемами этанола, центрифугируют, осадок растворяют в воде и высушивают сублимацией. 9 табл. ловиях, но и промышленные. кормовые дрожжи.Отделенные от культуральной жидкости и высушенные клетки гомогенизируют, растворимые вещества из гомогената экстрагируют 5 - 6-ной уксусной кислотой, центрифугируют и осадок отбрасывают. Экстракт упаривают в вакууме при 50 С и охлаждают, целевой продукт из концентрата осаждают двумя объемами этанола, центрифугируют, осадок растворяют в теплой воде и высушивают сублимацией.Выделенные данным способом препараты состоят преимущественно из полисахаридов, хорошо растворимы в воде и обладают высокой антивирусной активностью.П р и м е р 1.Дрожжи Сапбба ТгорсаИз Квыращивают в ферментерах на азрированной жидкой среде следующего состава; (КН 4)2304 3 г/л; йаС 3 0,3 г/л; М 93040,4 л;КН 2 РО 4 1 г/л; К 2 Н РО 4 0,1 г/л; гл юкоза25 г/л; биотин 2 мкг/л.Биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием (3000 об/мин, 15мин), высушивают в зсублимационной сушке(ЗЬ С, давление - 10 н/м ) и используют пом 9 ре получения антивирусного препарата.Дрожжевые клетки гомогенизируют с помОщью шаровой мельницы, растворимыевещества экстрагируют 6%-ной уксуснойкИслотой (2 ч при+2 С), осадок отбрасываю, а надосадочную жидкость доводят дон йтрального значения рН добавлением 5 нМаОН и концентрируют 1:5 упариваниемо(50 С) в вакууме. К охлажденному концентрату добавляют 2 объема 96%-ного этанолаи,осаждают целевой продукт при+2 С, Осадрк собирают центрифугированием и растворяют в теплой (50 С) дистиллированнойврде. Раствор центрифугируют, осадок отбвсасывают, а препарат сушат в сублимационной сушке,Выход очищенного препарата составляет 5,7% сухого веса дрожжей. Препаратимеет вид аморфного белого порошка. хорощо растворим в воде, термостабилен, нег 4 гроскопичен и может длительно храниться в сухом месте без изменения порошковидной консистенции и высокойантивирусной активности, В его составе более 80 углеводов, примесь белков составляет не. более 3%, нуклеиновых кислот -следы,П р и м е р 2, В качестве исходногоматериала используют сухие кормовыедрожжи промышленного изготовления, Экстракцию и очистку антивирусного началапроводят по той же схеме, что и в примере1. Для этого применяют уксусную кислоту в5%-ной концентрации. Выход препаратанесколько ниже (4,9), однако антивирусная активность его выше, чем при экстра. кции 6-ной кислотой. Препаратпредставляет собой аморфный порошокслабокоричневого цвета, хорошо растворим в воде, термостабилен, не гигроскопичен и может долго храниться в сухом местебез потери физических характеристик и антивирусной активности, Состоит преимущественно из полисахаридов, примеси белкойне превышают 5, нуклеиновых кислот -0,4.П р и м е р 3, Исходное сырье - промышленные кормовые дрожжи, Для экстракциии очистки антивирусного препарата исполь зуют уксусную кислоту в оптимальной концентрации (5,5). Выход препаратадостаточно высок -5,2, его антивируснаяактивность выше, чем при экстракции веществ 6-ной уксусной кислотой, В табл.1 приводятся сведения о составе и активности препаратов, полученных из различных источников, в отношении вируса табачной мозаики на дурмане,П р и м е р 4. Сухие дрожжевые клетки (40 г) обрабатывают 6 -ной уксусной кислотой по предлагаемому способу или водой(по прототипу). Растворимые вещества отделяют центрифугированием и в полученных экстрактах определяют содержание углеводов (0,2 -ным антроном в концентрированной Н 2304) и белков (по микрометоду Бредфорда), а также антивирусную актив- кость экстрактов (против ВТМ на листьях дурмана). Данные этого опыта приводятся в табл.2,3,4,10 15 Целевой продукт, экстрагированный бо -ной уксусной кислотой, по антивирусной активности существенно не отличается от продукта, полученного согласно способу- прототипу. Тем не менее содержание углеводов, являющихся действующим началом препарата, в этом препарате в 1,5 раза. выше, чем в препарате, экстрагированном водой. В то же время большую долю (31%) последнего составляют белки, содержание которых в целевом продукте, экстрагированном 6 -ной уксусной кислотой, не превышает 2 М,. 202530П р и м е р 5. 250 мг дрожжевых клетокСапбба 1 горсаз К- высушенных лио фильно, гомогенизируют и целевой продуктиз них экстрагируют 3 -, 5 -, 6%-, 8-, 10%- или 15 -ной уксусной кислотой. Далее экстракт концентрируют упариванием в вакууме, осаждают спиртом. Определяют 40 суммарное содержание белков и полисахаридов в препаратах и их способность ингибировать инфекционность ВТМ на листьях дурмана.Данные этого опыта, приведенные в 45 табл.5, показывают, что по мере увеличенияконцентрации уксусной кислоты с 3 до 106 выход полисахаридов повышается, а выход белков, наоборот, снижается (с 3,4 до 1,4).Дальнейшее увеличение концентрации кис лоты (до 15 о ) сопровождается снижениемвыхода полисахаридов, Антивирусной активностью обладают все препараты. Однако наиболее высокую активность отмечают у. препаратов, экстрагированных 5-6-ной 55 уксусной кислотой. Препараты, выделенныепри более высокой концентрации кислоты (8-15) в сравнимо низких (1 мкг/мл) концентрациях, не обладают активностью либо эта активность непостоянна. Намного мень-ией оказалась и активность препарата, экс 16590535 10 20 25 30 35 40. дня между смежными обработками. Учиты 50 55 трагированного 3-ной уксусной кислотой,вероятно, из-за присутствия примесей, сни-.жающих активность ингибиторов, либо стимулирующих инфекционность вируса.При испытании действия различныхконцентраций уксусной кислоты в качествеэкстрагента целевого продукта в данномопыте нейтрализация ее щелочью сознательно не проводилась. Это дало возможность определить, насколько высокиеконцентрации водородных ионов могут отрицательно повлиять на активность антивирусного начала. Измерения показывают, чтозаданные определенной концентрациейкислоты значения рН существенно не повышаются в процессе концентрирования экстракта в вакууме благодаря испарениюкислоты. Так, при концентрации кислоты 56 значение рН экстракта после концентрирования продукта в вакууме не выходитза пределы 1 - 2, при этом антивирусная активность целевого продукта (по сравнениюс более низкой концентрацией экстрагента -3 ь) не уменьшалась,Таким образом, оптимальная концентрация уксусной кислоты, обеспечивающаядостаточно высокий выход препарата, отсутствие в нем существенных примесейсопутствующих белков и хорошую сохранность антивирусной активности целевогопродукта, находится в пределах 5-6.П р и м е р 6. В опыте используют сухиеклетки дрожжей Сапбда тгорсаз К - 41,Получение антивирусного препаратапо предлагаемому способу,40 г дрожжевых клеток гомогенизируюти целевой продукт экстрагируют 400 мл бф 4 ной уксусной кислоты (2 ч при температуре+ 20 С), экстракт отделяют от гомогенатаклеток центрифугированием и упариваютдо 100 мл в вакууме. Целевой продукт изконцентрата осаждают, двумя объемамиспирта, осадок растворяют в воде и лиофилиэируют. На всех стадиях получения препарата определяют содержание углеводов, 4белков в экстрактах и антивирусную активность экстрагируемых веществ.Получение антивирусного препарата поспособу-прототипу,40 г дрожжевых клеток гомогенизируют, целевой продукт экстрагируют 400 млводы (2 ч при температуре +20 С), экстрактот гомогената клеток отделяют центрифугированием, а затем обрабатывают егоРНКазой в концентрации 20 мкг/мл (2 ч,+25 ОС в 0,001 М МаС). Экстракт концентрируют в вакууме до 100 мл, а затем эмульгируют в смеси фенола и хлороформа (9;1) втечение 30 мин при комнатной температуре,водную фазу с целевым продуктом отделяют центрифугированием и подвергают диализу (24 ч) против воды. Целевой продукт из диализата осаждают 5 объемами этилового спирта. осадок растворяют в воде и лиофиливируют, На всех стадиях получения препарата определяют содержание белков и углеводов в экстрактах и антивирусную активность экстрагируемых веществ.Данные сравнительной оценки предлагаемого способа и его прототипа приводятся в табл,6. Выход препарата, полученного по предлагаемому способу, в условиях этого опыта достигает 2,5. 8 то время как, используя способ - прототип, удается получить лишь около 0,7 оь препарата от веса исходного сырья.П р и м е р 7. Листья дурмана обрабатывают препаратом (1 мгlмл) за 48 ч до или сразу после заражения Х-вирусом картофеля (ХВК) путем погружения их в раствор испытуемого препарата. Контрольные листья аналогичным образом обрабатывают водой. Инфекционный титр вируса определяют через 5 дней посредством инокуляции экстрактами из, листьев дурмана растений ОоврЬгепа доэоза и подсчетом образовавшихся в опыте и контроле местных вирусных поражений.Данные, приведенные в.табл.7, свидетельствуют о существенном профилактическом эффекте в отношении ХВК. Отмечено снижение титра вируса (на 31 Оь) под влиянием препара;а, В системе табак - вирус бронзовости томатов (ВБТ) полученный антивиэусный препарат (АВП) применяют путем трехкратного опрыскивания растений до (профилактика) или после (терапия) инокуляции их инфекционным соком с интервалом 2-3 вают количество местных некрозов на инокулированных листьях, а также число системно пораженных растений, отмечают одновременно характер и степень проявления внешних симптомов заболевания.Данные этого опыта приведены в таблицах 8 и 9.Как следует из приведенных результатов, полученный АВП обладает высоким профилактическим и существенным терапевтическим (снижение гибели растений на 50 О при 100 О-ной гибели их в контроле) действием в отношении болезни табака, вызываемой ВБТ,Формула изобретенияСпособ получения антивирусного препарата иэ дрожжей, включающий культивировакие клеток, их отделение от культуральной жидкости, экстракцию очи1659053 упрощения технологического процесса и повышения выхода биомассы продукта, экстракцию и очистку проводят уксусной кислотой в концентрации 5-6.5 Таблица 1. Выход, состав и антивирусная активность препаратов, выделенных их дрожжейКонцентрация преп а рата,мкг/мл Состав и епа ата,Выходпрепарата,;6 Исходный материал РНК белки углеводы 5,7 1000100101 3,0 100 97 76 53 82,5 следы 1000100101 0,4 5,0 35,0 4,9 100917671 Таблица 2 Характеристика целевого продукта, экстрагированного из 40 г сухих дрожжей различными способамиО 6 белков от суммы био- полимеров Содержание биополимеров в экстрактах, мгАнтивирусная активность Экстракция используе- ингибировамая концент- ние ВТМ на рация; листьях дурмкг/мл мана,белков углеводов сумма 6 -ной уксусной кислоты 93 .680 +8 41 й 7 1,9. 1141,4 75 15 3 1120 21,4 Водой попрототипу) 31,0 378 75 15 3 1218 840 98 +5 90 ф 4 33 +12 П р и м е ч а н и е, Концентрация расчитывалась по содержанию углеводов в препарате. стку, и концентрирование экстракта в вакууме с последующим осаждением целевого продукта и его сублимационным высушиванием,отличающийся тем,что,сцелью Клетки дрожжей СапсИда 1 горсаПвК - 41, выращенные влабораторных условияхКормовые дрожжи,полученные в производственныхусловиях Ингибирование ин- фекционности виру са табачной мозаики на листьях дурмана,1659053 10 Таблица 3 Моносахаридный состав антивирусных препаратов, полученных с помощью известного и предлагаемого способаСо е жанне моносаха и а,Способ маннозэ галактоза амнозэ глюкоза 0,7 0,8 2,3 2,2 2,6 сле ы96,4 97,0 П р и м е ч а н и е. Содержание маносахаридов в препаратах определяют с помощьюгазо-жидкостной хроматографии. Препараты для ГЖХ получают путем гидролиза антивирусного препарата в 2 н серной кислоте (2 ч, 100 С). Таблица 4 Действие гидролаз на антивирусную активность антивирусного препарата, выделенного из дрожжей с помощью заявленного способаФерментная обработка Ингибирование вируса, 6в опыте в конт оле 0,8 99 +3 78 Таблица 5 Выход и антивирусная активность целевого продукта, экстрагированного из дрожжевых клеток уксусной кислотой различной концентрации1659053 12 Продолжение табл, 5стимуляция ционности ВТМ,Таблица,6равнительная эффективность двух способов получения антивирусного препаратаиэ клеток драакей СапдЫа сгор 1 са 11 з К 1 ,особ но из 4 я пре еток,ибироользуе конние ин итра ционносВТМ на итог он углено о угле дам),х ма кстракция 6 У.-ной укусной кислотой 1,4 1 редлага е 9,2 парнвани 1809,2 0,5 7 80 94 л 78 ф 1 ф 3 2 1 1007,111 Осакдение спирт 601 3 78,0 84 21+5 1,0 ото 90 ф 4 33+.1 4,0 1700 34 паривание в вак 13,6 30 91 ф ф 2 Экстракция водойботанной РНКазой(20 мкг/мл в 0,0Нас 1) 1 П Обработка фенольнохлороформной смесью, диалиэ, осалденпе спиртом Хбелкоот общегокол жествабиополимеров 3+ 6118г1659053 Табли.ца 7Действие антивирусного преперата (ЛВП) нз дрожжейна накопление Х-вируса картофеля в изолированныхполовинках листьев дурмана Время инкубации половиноклистьев АВП, 1 мг/ил , Ингибирование, Й Вода 35 24 31,439 40 +1, О 48 ч до инокуляции 48 ч после инокуляцииГ О,У,; Р 53. Таблица 8 Профилактическое действие антивирусного препаратаиз дрожжей на поражаемость табака сорта Иммунный580 ВБТф. Количество местныхпоражений/лист Вариант 0 а (контроль) 0 АВП, 0,02 Х 4 трехкраное опрыскивание растений с до ннокуляции растений ВБТ. тервалом Э дня Таблиц Терапевтическое антивирусное действне антивирусного препарата и дрожжей в системе табак сорта Иммунный 580 - ВБТ Вариант Колисество растений, Е 10 дней п.и. ЭО дней п.и, 50 дней п,и.ш ж3 1. Вода(контроль) 100 ВП, О, 022 Э 75 0 375 62 э 5 0 2 э 5 37прыскивание с интервалом 2 дня, начатоеаражения растений ВБТ: 1 - с суровыми - с мягкими симптомами; 2 - погибаие. Составитель С,ПыловТехред М,Моргентал Редактор В.Ковту орректор Т,Колб каз 1799Тираж 464 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина,трехкратное сразу после симптомами; 11,0 ф 1,4 1,Уф 0,03 Инфекционность экстрактов иэ листьев через 5 дней после заражения (некрозов) лист Количество растенийс системными симптомами болезни, Х Л 1 0 0 )00 0 0 000,0