Способ приготовления питательной основы микробиологических сред

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 690 А 1)5 С 12 И 1/О САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 2бавляют 0,17 л смеси растворов хлористоводородной и муравьиной кислот, взятых в концентрации 6 н и соотношении 1:1. Смесь автоклавируют при 121 С и давлении 1 атм в течение 45 мин, получают гидролизат, К гидролизату добавляют равную часть водопроводной воды и активированный уголь в количестве 20 г/л, тщательно перемешивают смесь в течение 1 ч. Смесь фильтруют под вакуумом через бумажный фильтр, Доводят рН фильтрата 10 Н р-ром гидроокиси калия до значения 6,5-6,8. Вновь добавляют 10 г активированного угля, смесь перемешива-ют и через 30 мин фильтруют, В полученный фильтрат вводят 10-12% осветленной молочной сыворотки, перемешивают смесь.Смесь упаривают на вакуум-выпарной ус- й тановке до содержания сухих веществ 20- 25. Сушеную смесь высушивают при температурах: 70. 5 С на выходе и 150- 5 С на. входе распылительной сушилки до остаточного содержания влаги 5. 1;.(46) 23.11.92, Бюл, М 43 (71) Всесоюзный научно-иссле институт комплексного испол лочного сырья(72) Т.Е,Шиловская и Е.Н.Лит (56) Денисова С,ВЛобова Е.А "О возможности создания м сывороточного производства ном использовании вторичног Гигиена и Санитария, 1988, М (54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛ ТЕЛЬНОЙ ОСНОВЫ МИКРО СКИХ СРЕД(57) Использование: в област вания микроорганизмов, в ч производства бактериальных ного назначения. Сущность с цельной крови животных стаб мл 10%-ным раствором лимон трия, К 0,5 л стабилизирован овательски зования мо Б.М. Изобретение относится к микробиолии и касается получения питательной осны микробиологических сред. тательных сред идефицитного пи огостоя ее вт замена дорогостщевого сырья на р щ оричное сырье.Известен способ приготовле тельной основы для выявления и лочнокислых бактерий в молоке и продуктах,. предусматривающий исходного сырья панкреатином в вии хлороформа, отличающийся целью повышения -степени выяв лочнокислых бактерий и улучшен вых свойств основы, в качестве сырья используют смесь подсыр ротки, мелассы и кормового вита взятых в следующем соотношени ящегоенее Существует достаточно большое к чество рецептур питательных сред, од число белковых основ и видов сырья для получения ограничено. Известны способы приготовления ковых основ для питательных сред п гидролиза исходного сырья животного исхождения. В качестве сырья применяют полноц ные белковые продукты, В условиях.об рившегося дефицита актуальна задач выборе сырья для приготовления основоли нако белутем проен т- о ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯРИ ГКНТ СССР винец ., Раскин алоотходного и рациональо сырья". - Ж.12, стр. 24-26. ЕНИЯ ПИТА- БИОЛОГИЧЕи культивиродстности для сред различпособа: 0,5 л илизируют 35 нокислого наной крови дония пита- учета мо- МОЛОЧНЫХгидролиз присутсттем, что с ЛЕНИЛ МОИЯ РОСтОИСХОДНОГО Ной СЫВО- мИН 1 В 12, и, м;.с.",;Подсырная сыворотка 65,0-75,0 Меласса 24,7-34,5 Кормовой витамин В 12 0,3-0,5 а гидрализ смеси ведут до содержания аминного азота 85-100 мг и редуцирующих сахаров 9-10=,ь 1.Однако при гидролизе белка в присутствии углеводов разрушается значительное количество аминокислот, в том числе незаменимых 2.В качестве прототипа можно считать способ приготовления питательной основы путем гидролиэа отходов сывороточного производства при переработке крови - эритроцитов 33.Способ предусматривает гидролиз сырья крепкой соляной кислотой до содержания аминного азота 495 мг, осветление полученного гидролизата активированнцм углем, сгущение и сушку до содержания сухих веществ 96%, Однако использование этого способа возможно лишь на предприятиях, имеющих цеха и оборудование по переработке крови,Применение крепкой соляной кислоты при гидролизе эритроцитов приводит к разрушению ряда аминокислот. Кроме того, в процессе осветления, полученный гидролизат довольно обедняется витаминами и минеральными веществами.Цель изобретения - упрощение способа и расширение спектра культивируемых микроорганизмов.Поставленная цель достигается применением в качестве сырья для приготовления питательной основы цельной крови животных и молочной сыворотки, которые содержат все необходимце для питания микроорганизмов ингредиенты: азотистые и углеродсодержащие вещества; углеводные компоненты, фосфорные соединения и витамины.Белковые вещества крови по своему аминокислотному составу относятся к полноценным белкам,Применение вторичного сырья мясной и молочной промышленности позволит решить ряд проблем по рациональному использованию имеющихся ресурсов пищевого сырья, внедрение в производство безотходных технологических процессов, предотвращение загрязнения окружающей среды, что имеет экологическое значение, а масштабы производства позволяют получать большое количество такого сырья,Среди отходов молочной и мясной промышленности обращают внимание кровь и молочная сыворотка, характеристика которых представлена в табл. 1, 20 30 35 ной основы необходима ее стабилизация, в 40 45 50роточных белков 5 10 15 Кровь содержит в значительном количестве белки почти без углеводов; в то же время молочная сыворотка содержит много углеводов, особенно, дисахарид, лактозу и мало белков.Основной состав крови постоянен, чему способствует деятельность выделительнцх систем органйзма животных, идет постоянное обогащение ее гормонами, ферментами и другими биологически активными веществами,Кровь и молочная сыворотка полностью соответствуют требованиям, предъявляемым к сырью при приготовлении основ и сред в производственном масштабе: высокая питательная полноценность, доступнЬсть, низкая стоимость.Исследования отходов мясной и молочной промышленности, в частности сыворотки и крови животных, показали, что их окисляемость достигает 440000 мг/л и биохимическое потребление кислорода до 1580 м/л в сутки.Такие отходы перед сбросом в канализацию нуждаются в разведении не менее чем в 400 раз, что связано с потреблениемзначительного количества пресных вод,Следовательно, остро стоит проблема утилизации указанного сырья. В то же время увеличение переработки скота на мясокомбинатах приводит к значительномуросту ресурсов крови.При использовании крови животных какодного из основных компонентов питательрезультате чего увеличивается количествобелковых веществ за. счет остающегося вней фибриногена и эритроцитов,Способ производства питательной основы осуществляется следующим образом Стабилизированная 10-нцм раствором лимоннокислого натрия кровь животнцх нагревается с 6 н раствором смесисоляной и муравьиной кислот в соотношении 1: 1 автоклавированием при температуре 121 С, давлением 1 атм, в течение 45 мин. В полученный гидролизат добавляют активированный уголь из расчета 20 г/л иравную часть водопроводной воды. Смесь перемешивают в течение 60 мин,после чего фильтруют под вакуумом.Фильтратоттитровывают с помощью раствора щелочи до рН 6,5, повторно добавляют активированный уголь и снова фильтруют. Молочная сыворотка подвергается тепловой обработке с целью коагуляции сывоОптимальный режим коагуляции сывороточных белков можно принять следую 177669040 45 50 щий: нагревание до температуры 92,5 й2,5"С; подкисление до рН 4.5.ф. 0,1, что соответствует 30-35 Т; выдержка при даннойтемпературе 5 мин; раскисление до рН6,25+ 0,25 (10-150 Т); выдержка не менее 15 5мин, фильтрация.Затем кислотный гидролиэат крови смешивается с осветленной молочной сывороткой,Приготовленную по предлагаемому 10способу смесь сгущают на вакуум-выпарнойустановке до содержания сухих веществ 20.25 и высушивают на распылительной сушилке до остаточного содержания влаги5-6. 15Обычно гидролиз животных белков осуществляют 6 н раствором соляной кислоты.Однако применение сильных кислот способствует более глубокому распаду белков, 20тем самым ухудшая качество гидролиэата. Всвязи с изложенным, для проведения гидролиза нами была опробована муравьинаякислота, которая по сравнению с солянойсчитается более мягкой, Но применение одной муравьиной кислоты для гидролиза крови при укаэанных режимах не далодолжного эффекта. Отрабатывались различные соотношения соляной и муравьинойкислот: 2:1; 1:1; 1;2, Оптимальным по аминному азоту оказалось соотношение кислот1: 1. При проведении кислотного гидролиэанемаловажным фактором является гидромодуль. Оптимальным принят гидромодуль1 35- , так как при более низких концентрациях3кислоты получаются гидролиэаты, не поддающиеся фильтрации,Последующие операции осуществляются с целью обесцвечивания гидролиэата и частичного удаления кислот адсорбцией древесным углем.При проведении исследований выяснилось, что основным условием фильтрования полученных гидролизатов является 2-х кратное разведение их водопроводной водой. Затем вносят активированный уголь,Недостаток витаминов и минеральных веществ, удаленных из гидролизата вследствие его очистки активированным углем будет восполнен при внесении 10-12 осветленной молочной сыворотки, которая по набору и абсолютному содержанйа витаминов является биологически полноценным продуктом. Количество отдельных аитаминов в сыворотке несколько выше, чем в молоке в результате молочнокеслого процесса. При коагуляции белка под действиемтемпературы и изменений рН в сывороткеосуществляется некоторый распад углевода- лактоэы. Таким образом, питательная основа в своем составе содержит как дисахарид, так и моносахарид, и, следовательно,ее можно использовать при выращиванииразличных групп микроорганизмов,Кроме того, добавление 10-126 осветленной сывсротки в питательной основе является оптимальным, поскольку общеесодержание углеводов будет в пределах0,45-0,53, что вполне обеспечивает энергетический обмен микроорганизмов,Полученные питательные основы с 89 и 13-14 молочной сыворотки при испытании в средах показали несколькоменьший рост микроорганизмов, например, стафилококков.Полученная основа является достаточно полноценной, Содержание аминногоазота 620-800 мг, общего азота 1000-1200мг., Степень расщепления белка 0,63+ 0,1.На полученной основе можно готовитьобщепринятые питательные среды для выращивания широкого спектра микроорганизмов. В питательную основу добавляютагар-агар микробиологический 2-5, другие компоненты в зависимости от питательных потребностей микроорганизмов иавтоклавируют при 1210 С в течение 15 мин.Питательные среды с использованиемпредлагаемой основы не уступают общепринятым по биологическим показателям,что показано в таблице,Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что составосновы отличается от известных питательных сред в результате использования нового совмещенного компонентного составасырья мясной и молочной промышленности, полученного в результате гидролизабелковых молекул крови и последующегообогащения ее витаминным и углеводнымсоставом молочной сыворотки, что соответствует. критерию "новизна",Существенными признаками изобретения являются:1) Использование в качестве исходногосырья цельной крови животных вместоэритроцитов крови лошади по прототипу.Это упрощает способ (нет необходимостивыделять эритроциты и вести длительныйгидролиз при высокой температуре), обогащает основу (эа счет использования белкаплазмы крови), дает воэможность расширить границы определения различныхгрупп микроорганизмов (на основе по прототипу растут только патогенные микроорганизмы, в то время как на предлагаемой50 55 основе, кроме патогенных, растут молочнокислые и др. микроорганизмы), экономит энергию и материалы (за счет сокращения длительности гидролиза, более низкой температуры и меньшего расхода кислоты);2) Проведение кислотного. гидролиза 6 н раствором смеси соляной и муравьиной кислот в соотношении 1;1, вместо 0,66 н соляной кислоты (что обеспечивает менее жесткий гидролиз и сохраняет необходимые для роста различных групп микроорганизмов вещества в основе).3) Количество вносимой кислоты: 5,3 объема кислоты.на 1 объем эритроцитов по прототипу и 0,34 объема кислоты на 1 объем крови по предлагаемому способу (повышает экономичность способа).4) Добавление 10-12 осветленной молочной сыворотки (обогащает основу углеводами и сывороточными белками, что способствует расширению границ определения различных групп микроорганизмов).Значения рН в предлагаемом способе в пределах 6,5-6,8 вместо 4,7-4,8 по прототипу предполагают большую возможность варьирования в зависимости от вида микроорганизмов, для которых готовится основа,8 ыаокая температура и длительность автоклавирования в прототипе необходимы для гидролиэа эритроцитов. При более низкой температуре процесс не пойдет, в то время, как гидролиз крови идет значительно быстрее и при более низкой температуре.В табл. 4 показана зависимость роста микроорганизмов от соотношения кислот при гидролизе основы и значения рН. Оптимальным является соотношение 1:1.Анализ известных составов питательных сред, используемых в микробиологии показал, что для приготовления сред используется сырье мясного производства. Однако по способу обработки и химическому составу эти среды существенно отличаются от предлагаемого, что придает новые свойства средам, приготовленным на предлагаемой питательной основе. Это позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию "существенные отличия".Осуществление заявляемого способа поясняется с помощью примеров:П р и м е р 1. Берут 0,5 л цельной крови животных, смешивают с 35 мл 10-ного раствора лимоннокислого натрия. Стабилизированную кровь смешивают с 0,17 л смеси (1:1) 6 н растворов соляной и муравьиной кислот. Смесь тщательно перемешивают и автоклавируют при 121 С и давлении 1 атмосферы в течение 45 мин. По окончании гидропиза к полученному гидролизату в ко 5 10 15 20 25 30 35 40 45 личестве 0,5 л добавляется такое же количе ство водопроводной воды и 20 г активированного угля, тщательно перемешивают в течение 1 ч, после чего фильтруют под вакуумом через бумажный фильтр.Активную кислотность фильтрата доводят с помощью 10 н раствора КОН до рН 6,5-6,8 и добавляют еще раз 10 г активированного угля. Смесь перемешивают и через 30 минут фильтруют.Параллельно с проводимой работой подготавливают молочную сыворотку, С целью коагуляции.сывороточнцх белков подсырную сыворотку подкисляют до рН 5- 4,5, нагревают до температуры 95 С и выдерживают 5 мин, а затем фильтруют.Полученный гидролизат крови в количестве 1 л смешивают со 100 мл осветленной молочной сыворотки.Подготовленную смесь сгущают на вакуум-выпарной установке при температуре не выше 65 С до содержания сухих веществ 20-25 О и высушивают на распылительной сушилке до остаточного содержания влаги 4-6;4. Допустимая температура нагрева в процессе сушки 130 С,Питательная основа, приготовленная по предлагаемому способу, может использоваться при приготовлении сред для выявления и учета молочнокислых бактерий, кишечной палочки, стафилококков.Примеры 2, 3, 4 осуществляются по примеру 1, Данные приводятся в таблице.Изучен рост различных видов микроорганизмов (молочнокислых бактерий Ясг. асбз, Зк баейасбз, .сЬ, Ьцдагсца; колиформнцх бактерий Е. со; патогенных ЯтарЫососсоз ацгеоз) на опытной питательной основе с различным процентным содержанием молочной сыворотки.Максимальный рост молочнокислых бактерий отмечен на среде, приготовленной на питательной основе с содержанием молочной сыворотки 12-13 максимальный рост патогенной микрофлоры на средах, приготовленных на питательной основе с 9-10 О молочной сыворотки.Использование заявляемого технического решения в качестве основы для питательных сред позволяет: а) увеличить границы определения различных групп микроорганизмов; б) увеличить высеваемость живых клеток микроорганизмов; в) максимально использовать вторичное сырье мясной и молочной промышленности, что имеет экологическое значение в масштабах страФормула изобретенияСпособ приготовления пиа. .чьной ос. новы микробиологическг: ,1;,1 н 1 нак 11776690 10 Табл и ца 1 Физико-химические показатели крови и молочной сыворотки аблиц аб щий добавление к исходному сырью хлористоводородной кислоты, автоклавирование, фильтрацию полученного гидролизата, нейтрализацию его, осветление нейтрализата с помощью активированного угля и сушку целевого продукта при температуре 150 ОС на входе и 75 С на выходе сушильной установки, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и расширения спектра культивируемых микроорганизмов, в качестве исходного сырья используют стабилизированную кровь животных, к которой добавляют в соотношении 1; 0,34 смесь 6 н растворов хлористоводородной кислоты и муравьиной кислоты, взятых в соотношении 1:1, автоклавирование проводят при 121 С в течение 45 мин, после автоклавировэния 5 полученный гидролизат разводят водопроводной водой в соотношении 1:1 и добавляют активированный уголь, полученную смесь фильтруют, а фильтрат нейтрализуют гидроокисью калия до рН 6,5-6,8, к освет ленному нейтрализату добавляют 10-12осветленной молочной сыворотки, перед сушкой смесь сгущают до массовой доли сухих веществ 20-25,12 1776690 таблица 4 Питательная среда . Среднее количество колоний на чашках пря посеве культур: 1 Ю Ыагй 8 г ЗмЖЛыы 4 Ъйа 4 М Ж 4 етю аие 4,0 хХ 07 12 Ох 108 2 Ях 108 3,5 х 07 27 хХ 08 П,Ох 108 1 палица 5. Соотноаение ЫсоланойМассовая доля 1 Количество микроорганизмови ЮревьиноййнслотХЕ среди 1 аминногд азомолочнокнслнх ктерий 1 коащлззопоащителннхтстаФилококков 2 Х 6,0401. 6 Ф 0,1 7 ОЙО,Х 5, Хх 106 7,2 хХ 08 . 4,8 х 106 1:2 Табяица,6 1 СоотнощениеКоличество 1 Массовая доля 1 Колячесттво, КОЕ1 6 н 1 иносямойПРиеР фраотноров молочной 1 ванного 1 угленодоз, 1 иитзмкноа молочно коагулзэопололя 1 онноротки 11 азота,1 мг кг1 кислюфакт. тельных стафял. Х:1 1:Х 1 гй Составитель Е.ЛитвинецТехред М.Моргентал . Корректор Н, Ревская Редактор Тираж Подписное Заказ 4100 нияз и отк ытиям при ГКНТ СССР ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и р 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5