Способ определения бензодиазепинов в сыворотке крови и среда инкубации для его осуществления

,Сд )Ж ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС(71) Всесоюзный научный центр психического здоровья АМН СССР(56) Патент США К". 4239744, кл. 424-1.Патент США М 4280993, кл, 424-1, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕНЗОДИАЗЕПИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И СРЕДА ИНКУБАЦИИ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ(57) Изобретение относится к области био- логии, в частности к биологической химии, и касается способа измерения уровня диазепама в биологических жидкостях. Изобретение может быть использовано в лечебной практике для проведения лекарственного мониторинга, а также скрининга новых психотропных препаратов и проведения клиниИзобретение относится к биологии, в частности к биологической химии, и касается способа измерения уровня бензодиазепинов в биологических жидкостях.Изобретение может быть использовано в лечебной практике для проведения лекарственного мониторинга путем определения в крови и иных биологических жидкостях концентраций бензодиазепинов и других веществ, имеющих сродство к бензодиазепиновым рецепторам, в области клиникофармакологических исследований, например для исследования фармакокинетики лекарственных соединений из класса бензодиазепинов, установления. зависимости эффектов препаратов от уровня активных форм в крови при различных путях 1737338 А 1 ко-фармакологических исследований. Целью изобретения является упрощение и повышение чувствительности способа из-. мерения уровня бензодиазепинов в сыворотке крови. Способ заключается в предварительной обработке сыворотки крови с помощью этилового спирта без дальнейшего отделения белкового преципитата, смешении ингредиентов инкубационной смеси (в качестве радиоактивного лиганда используется Н-Ко 15 - 1788, антагонист3бензодиазепиновых рецепторов, инкубационная смесь содержит 500 мкМ ГАМК), инкубации, разделении свободного и связанного с рецептором меченого лиганда; просчете радиоактивности связанного меченого лиганда; расчете процента ингибирования и определении диазепара в исследуемом образце с помощью рассчитанного на основе контрольной точки коэффициента. 2 с.п, флы, 5 табл,введения; в исследованиях по экспериментальной фармакокинетике; для скрининга новых психотропных препаратов на специфическую биологическую активность.Целью изобретения является упрощение способа определения уровня бензодиазепинов в крови и увеличение чувствительности среды инкубации.Цель достигается тем, что предварительную обработку образца сыворотки крови проводят с помощью добавления к образцу этилового спирта (к 20 мкл сыворотки 45 мкл спирта), смесь инкубируют 15 - 20 мин при комнатной температуре, далее без отделения свободного от белков образца добавляют остальные ингредиенты инкубационной смеси; в качестве радиоактивного50 55 лиганда используют Н - Ко 15 - 1788, антагознист бензодиазепиновых рецепторов; для работы используют трис-НС буфер, содержащий 500 мкМ гамма-аминомасляной кислоты (ГАМ К), которая увеличивает сродство бензодиазепиновых рецепторов к агонистам (исследуемый препарат), не изменяя сродство рецепторов к антагонистам (радиоактивный лиганд), Таким образом, достигается преимущество связывания со специфическими местами для исследуемого препарата; расчет концентраций препарата в сыворотке крови производится без построения калибровочной кривой, на основе коэффициента пересчета, определяемого по одной контрольной точке.Используют концентрацию меченого лиганда, равную 0,3-0,4 нМ в пробе. Выбор ее обусловлен тем, что по теории ингибиторного анализа рецепторного связывания максимальная чувствительность наблюдается при концентрации меченого лиганда в пробе порядка 0,1-0,2 Кд(Кд - равновесная константа диссоциации меченого лиганда), Снижение концентрации ниже этих значений не имеет смысла, т.к. дальнейшего увеличения чувствительности не дает и ведет лишь к снижению счета радиоактивности, что повышает ошибку определения.Способ осуществляется следующим образом.В пробирке смешивают сыворотку крови с этиловым спиртом, перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 15-20 мин. После этого добавляют меченый лиганд Н - Во 15-1788, рецепторный матезриал, перемешивают и инкубируют при 0 С в течение 50 - 60 мин. Инкубационная смесь содержит 500 мкМ ГАМК, Далее разделяют свободный и связанный радиоактивный лиганд с помощью фильтрации под вакуумом и просчитывают радиоактивность связанного лиганда на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Концентрацию исследуемого бензодиазепина определяют с помощью рассчитанного коэффициента пересчета, который определяют на основе контрольной точки.Набор для осуществления способа содержит следующие компоненты: Н-Ко 15 -,з1788, в качестве мембранного препарата рецептора - синаптосомальную фракцию серого вещества коры головного мозга быка, стандартную сыворотку от психически здоровых доноров без диазепама и контрольную сыворотку с концентрацией диазепама 100 нг/мл, 2 мМ раствор немеченого диазепама, навески для приготовления трис - НС буфера, содержащего ГАМК, и буфера для промывки фильтров. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 П р и м е р 1 (по прототипу),1. Материалы и методы,Рецепторный материал: серое вещество коры больших полушарий мозга быка гомогенизируют в 50 объемах 0,32 М сахарозы, гомогенат центрифугируют при 1000 х д 15 мин, Супернатант переливают в другую пробирку, а осадок ресуспендируют в 0,32 М сахарозе и центрифугируют в тех же условиях. Объединенные супернатанты центрифугируют при 17000 х д 30 мин. Далее полученный осадок трижды промывают в 100 объемах 50 мМ трис-НС, буфера, рН 7,4, с помощью ресуспендирования и центрифугирования при 30000 х д 25 мин, Конечный осадок разводят этим же буфером до концентрации 200 мг исх, ткани/мл. Суспензию разливают на аликвоты и хранят до использования при -70 С. Характеристики рецепторного материала: Кб = 4,6 + 0,4 нМ, максимальное число мест связывания 20 + 1,4 фмоль/мг исходной ткани для Н-диазепама,Стандарты: для измерения уровня диазепама используют сыворотку крови без диазепама и сыворотки, содержащие известное количество диазепама в диапазоне концентраций от 10 до 2000 нг/мл, которые готовят путем серийных разведений под контролем весов,Меченый лиганд: Н-диазепам фирмы "Ащегэ Ьаа", 81 Ки/ммоль.2, Процедура определения,Сыворотку крови разводят дистиллированной водой в соотношении 1: 5. К 1 мл разведенной сыворотки добавляют 50 мкл перхлорной кислоты, перемешивают и центрифугируют при 1500 х д 15 мин. К 25 мкл супернатанта добавляют 375 мкл дистиллированной воды, 1 мл рецепторного материала, который перед употреблением размораживают, разводят 1: 10 трис-НС буфеоом, рН 7,4, и гомогенизируют, и 100 мкл Н-диазепама (конечная концентрация в пробе ЗнМ). Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют в водяной бане при 0 С в течение 50 - 60 мин. Далее содержимое пробирок фильтруют через стекловолокнистые фильтры ОР/В ("ОВатаап"), фильтры промывают 2 раза по 5 мл холодным трисНС буфером и помещают в сцинтилляционные флаконы с сцинтилляцион ной жидкостью, Радиоактивность подсчитывают через 6 - 18 ч.Расчет концентраций диазепама в исследуемых образцах: для каждой пробы вычисляют процент ингибирования ЕЗВо/ЯВ - 1, где БВо - специфическое связывание в образце с сывороткой беэ диазепама, ЯВ - специфическое связывание в исследуемых образцах. Концентрацию диазепама определяю. по калибровочной кривой на основе рассчитанного процента ингибирования,П р и м е р 2 (предлагаемый способ), 1. Материалы и методы.Рецепторный материал: серое вещество коры больших полушарий мозга быка гомогенизируют в 50 объемах 0,32 М сахарозы, гомогенат центрифугируют при 1000 х д 15 мин. Супернатант переливают в другую пробирку, а осадок ресуспендируют в 0,32 М сахарозе и центрифугируют в тех же условиях. Объединенные супернатанты центрифугируют при 17000 х д 30 мин, Далее полученный осадок трижды промывают в 100 обьемах 50 мМ трис-НС буфера, рН 7,4, с помощью ресуспендирования и центрифугирования при 30000 х д 25 мин, Конечный осадок разводят этим же буфером до концентрации 200 мг исх. ткани/мл, Суспензию разливают на аликвоты и хранят до использования при -70 С, Характеристики рецепторного материала; Кб =4,6+ 0,4 нМ, максимальное число мест связывания 20+ 1,4 фмоль/мг исходной ткани для Н-диазезмапа; Кб = 2,3 + 0,2 нМ, максимальное число мест связывания 31,2 + 1,8 фмоль/мг исходной ткани для Н-Яо 15-1788.зСтандарты: в работе используют стандартную сыворотку диазепама и контрольную сыворотку, содержащую 100 нг диазепама/мл, Для характеристики способа используют также сыворотки, содержащие известное количество диазепама в диапазоне концентраций от 10 до 2000 нг/мл, которые готовят путем серийных разведений под контролем весов,Меченый лиганд, Н-Ко 15 - 1788 фирмы "Ней", 81 Ки/ммоль,Все используемые реагенты (кроме сывороток) готовят на 50 мМ трис-НС буфере, содержащем 500 мкМ ГАМ К, рН 7,4,2. Процедура определения.В стеклянной пробирке объемом 5 мл смешивают 20 мкл сыворотки, не содержащей диазепам, содержащей 100 нг диазепама/мл или калибровочные сыворотки, и 45 мкл этилового спирта 96(конечная концентрация в инкубационной среде 3 ). Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 15-20 мин. После этого добавляют 1 мл Н - Во 15-1788(конечная концентрация 0,3-0,4 нМ) и 0,5 мл мембранного препарата рецептора, который перед употреблением размораживают, разводят в 30 раз трис-НС буфером, содержащим 500 мкМ ГАМК, и гомогенизируют, Содержимое перемешивают и инкубируют в водяной банепри 0 С 50 - 60 мин, По окончании инкубации пробы немедленно фильтруют через 6 Е/В фильтры,Фильтры промывают 2 раза по 5 мл холодным трис-НС буфером и перемешивают в5 сцинтилляционные флаконы с сцинтилляционной жидкостью. Радиоактивность пробпросчитывают через 6 - 18 ч. Для определения неспецифического связывания в пробирки, содержащие сыворотку без10 диазепама, вносят по 10 мкл 2 мМ растворанемеченого диазепама до добавления в нихН - Ко 15 - 1788.3, Расчет концентраций диазепама в сыворотках,15 Для каждой пробы вычисляют величинуспецифического связывания как разностьмежду пробами, не содержащими и содержащими избыток немеченого диазепама,Для каждой пробы определяют величи 20.ну Е 1:Е = ЯВ/ЯВ - 1где ЯВ, - величина специфического связывания в образце с сывороткой без диазепама;25 ЯВ - величина специфического связывания в определяемом образце,Вычисляют коэффициент пересчета К:К = Е/100,где Ек - величина Е для контрольной сыво 30 ротки,100 - концентрация диазепама в этойсыворотке, нг/мл.Определяют концентрацию диазепамав исследуемых сыворотках С.35 С, := Е/К.П р и м е р 3. Аналогично примеру 2, нов качестве радиоактивного лиганда используют Н-диазепам в концентрации 1,0 нМ впробе (0,2 Кб).40 П р и м е р 4, Аналогично примеру 2, вкачестве радиоактивного лиганда используют Н-флюнитразепам в концентрации 0,4нМ в пробе (0,2 Кб),П р и м е р 5. Аналогично примеру 2, но45 концентрация ГАМК в инкубационной смеси равна 0; 100 кмМ; 1 мМ.П р и м е р 6, Аналогично примеру 2, нопредварительную обработку образца проводят с помощью 15; 30; 75 мкл этанола50 (конечная концентрация в инкубационнойсмеси равна 1: 2; 5 соответственно),П р и м е р 7, Аналогично примеру 2, нопредварительную обработку образца проводят с помощью 7; 15; 30; 45 мкл метанола55 (конечная концентрация в инкубационнойсмеси равна 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 соответственно),В табл,1 представлены данные по максимальной чувствительности способа (концентрация диазепама, вызывающая10 15%-ное ингибирование специфического связывания Н-лиганда) и по концентрациизполуингибирования специфического связывания меченого лиганда, полученные при проведении анализа известным и предлагаемым способами. Из табл,1 видно, что при проведении анализа предложенным способом (пример 2) чувствительность метода повышается в 3,2 раза по сравнению с прототипом (пример 1). Также отметим, что 50 %ное ингибирование связывания меченого лиганда вызывается концентрацией диазепама в предложенном способе в 5 раз меньшей, чем при проведении анализа по прототипу,В табл, 2 представлены данные о чувствительности метода при использовании различных меченых лигандов, Как следует из таблицы, применение Н-диазепамазухудшает чувствительность метода в 2,4 раза по сравнению с предлагаемым способом, При использовании Н-флюнитразепама взкачестве радиоактивного лиганда чувствительность метода в 1,7 раза ниже, чем при использовании Н-Во 15 - 1788 (предлагаемый способ). Это объясняется тем, что диазепам и флюнитразепам являются агонистами бензодиазепинового рецептора, поэтому в данном случае эффекта ГАМ К не наблюдается, т.е. создается преимуществ для связывания исследуемого вещества, которое также является агонистом рецептора,В табл.3 представлены данные о влиянии различных концентраций ГАМК на чувствительность метода, Так, при анализе в среде, не содержащей ГАМК, чувствительность метода падает в 1,5 раза. При концентрации ГАМК, равной 100 мкМ, чувствительность снижена в 1,4 раза, тогда как при концентрации 1 мМ чувствительность практически такая же, как и в предлагаемом методе. Поэтому в целях экономии реактивов в работе используют концентрацию ГАУК 500 мкМ,В табл,4 представлены данные о влиянии этилового спирта на специфическое связывание. Н-Во 15-1788, а также об ингибировании чистой сывороткой (без диазепама) и сывороткой с концентрацией диазепама 100 нг/мл (концентрация полуингибирования) специфического связывания меченого лиганда в присутствии различных концентраций этанола, Из табл.4 следует, что сам эта нол ингибирует связывание Н-Яо 15 - 1788 с дозозависимым эффектом. Однако при этом также необходимо отметить, что по мере возрастания концентрации этанола в инкубационной среде специфического связывания Н-Яо 15-1788з 15 20 25 30 35 40 45 50 55 чистой сывороткой значительно уменьшается, достигая 1,8 - 1,0% при 3 - 5% этанола. Подобный эффект можно объяснить тем, что при добавлении этанола к сыворотке происходит высаживание белков таким образом,что они становятся неспособными в дальнейшем связывать меченый лиганд, что является, по-видимому, причиной снижения ингибирующего действия сыворотки крови на связывание меченого лиганда, Из табл.4 также видно, что по мере возрастания концентрации этанола процент ингибирования сывороткой, содержащей 100 нг диазепама/мл, увеличивается, что говорит об увеличении чувствительности метода,В табл,5 представлены данные о влиянии метанола на специфическое связывание Н - В 15 - 1788, а также об ингибировании специфического связывания меченого лиганда чистой сывороткой и сывороткой с концентрацией диазепама 100 нг/мл, Из табл.5 видно, что метанол сильно ингибирует связывание Н-Ко 15-1788 - уже при егозконцентрации 0,5%-ное ингибирование достигает 68,5%, При концентрации метанола в инкубационной смеси 1,0; 2,0 и 3,0% ингибирование достигает 81,7; 88,5; 931% соответственно, И хотя при концентрации 0,5% ингибирование чистой сывороткой специфического связывания Н-Яо 15 в 17 неззначительно, рабочий диапазон метода настолько сужен (счет радиоактивности при этом составляет не более 150 сра), что ошибка определения составляет более 70%. В силу этих причин проводить предварительную обработку исследуемого образца метанолом не представляется возможным.В связи с тем, что зависимость величины Р (равной ЯВС,/ВЯ) от концентрации диазепама в сыворотке линейна, в диапазоне концентраций от 10 до 1500 нг/мл мы отказались от построения калибровочной кривой для определения уровня диазепама в исследуемых образцах, а для расчета концентраций использовали коэффициент пересчета К = Р/100, вычисленный для контрольной сыворотки, Концентрация диазепама выбрана как вызывающая 50%-ное ингибирование специфического связывания Н - Во 15 - 1788 в данных условиях позстан овки эксперимента, Для более надежного определения коэффициента величины ЯВо, ЯВ определяются в 4 параллелях излучения. Распределение ошибки определения при расчете концентраций бензодиазепина в исследуемых образцах с помощью коэффициента пересчета от концентрации диазепама в сыворотке показало, что ошибка определения в диапазоне концентраций от 100 дс 1500 нг/мл не пре5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 вы шает 10 /, в области от 20 до 50 н г/мл она равна 20-15 о , что является верхней границей допустимой ошибки для биологических методов, Учитывая то, что терапевтический диапазон концентрации диазепама в сыворотке крови составляет 50 - 2000 нг/мл (при различных способах введения лекарственного средства), увеличение ошибки определения при малых концентрациях не снижает достоинств предлагаемого способа. Коэффициент корреляции между добавленным в сыворотку известным количеством диазепама и определенным предлагаемым способом составил 0,97 в диапазоне концентраций от 20 до 2000 нг/мл, что говорит о высокой точности способа.Предлагаемый способ прост в исполнении, поскольку исключает этапы центрифуги рования, переноса али квот и дополнительного разведения образца при проведении предварительной обработки. Значительно упрощен расчет концентраций бензодиазепина в исследуемых образцах сыворотки, т.е. исключается построение калибровочной кривой, что уменьшает объем работы. Кроме того, чувствительность способа в 3,2 раза выше по сравнению с прототипом и является достаточной для определения диазепама в сыворотке крови больных, находящихся на курсовой терапии бензодиазепинами, Для определения уровня других бензодиазепинов в сыворотке крови (не диазепама) требуется в качестве контрольной сыворотки использовать сыворотку, содержащую интересующий бензодиазепин.Упрощение способа определения бензодиазепинов и увеличение чувствительности означает, что предлагаемый способ может быть использован для проведения широкого лекарственного мониторинга в клинической практике, Применение предлагаемого тест-набора для осуществления способа значительно упростит работу персонала биохимических лабораторий, Данный способ может быть использован в клиниках для определения целесообразности применения данного препарата у конкретного больного, Проведение клинико-фармакологических исследований с целью оптимизации психофармакотерапии, например для установления взаимосвязи фармакокинетических параметров после введения разовой тест-дозы и последующей эффективности терапии бензодиазепинами, а также предикция равновесного содержания препарата в сыворотке крови при курсовой терапии на основе тест-дозы,установления зависимости развития побочных эффектов от концентрации препарата в сыворотке, может значительно облегчить выбор препарата для лечения больного, установление оптимальных дозировок, режимов и путей введения. Кроме того, предлагаемый способ может быть использован для исследования фармакокинетики вновь синтезируемых лекарственных соединений класса бензодиазепинов, а также для определения уровня других бензодиазепинов в сыворотке крови больных, т.к. способ является универсальным для препаратов этого класса,Формула изобретения 1. Способ определения бензодиазепинов в сыворотке крови путем обработки сыворотки, смешивания ее с рецепторным материалом и радиоактивным лигандом, инкубации полученной смеси с последующим отделением связанного с рецептором лиганда методом фильтрации, подсчета величины радиоактивности и расчета процента ингибирования связывания в сравнении с контролем, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа за счет исключения стадий, а также повышения чувстви-. тельности, сыворотку обрабатывают этиловым спиртом при объемном соотношении 1:2,25, в качестве радиоактивного лиганда используют Н-йо 15 - 1788, а в среду инкубации дополнительно добавляют у-аминомасляную кислоту в концентрации 500 мкМ,2, Среда инкубации для определения бензодиазепинов в сыворотке крови, содержащая рецепторный материал, радиоактивный лиганд, трис-буфер, немеченый диазепам, этиловый спирт, соляную кислоту, воду, о т л и ч а ю щ а я с я тем, что, с целью повышения качества за счет увеличения чувствительности определения, среда дополнительно содержит у- аминомасляную кислоту, а в качестве лиганда Н-Роз 15-1788 при следующем соотношении компонентов, на 1 мл: Рецепторный материал 0,136у-Аминомасляная кислота 5,15Этиловый спирт 3,0Н-йо 15-1788 5,88 10 -8,82 10Немеченый диазепам 3,64 101737338 12 Пример 16,78,5 1,0 9,5 Концентрация метанола в инкубационной срео 0,5 1,0 2,0 3,0 Ингибирование специфического связывания Нз йо 15-1788 метанолом,б 8,5 81,7 88,5 93,1 Ингибирование специфического связывания Н- йо 15-1788 сывороткой без диазепама Таблица 1 Таблица 2 ТаблицаЗ Таблица 4 Таблица 5 Ингибирование специфического связывания НВо 15-1788 сывороткой с 100 нгбез диазепама/мл,