Способ определения лимфоцитарных антигенов и антилимфоцитарных антител в сыворотке крови

ОЮЗ СОВЕТСКИХ ЦИДЛИСТИЧЕСКИХ СПУБЛИН 9) (11) А 33/50 1)4 С щЮЗВАЯ анино ИР 1 Е -д ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЕТЕЛЬСТВУ К АВТОРСКОМ я к медицинентификациии лимфоцитовител в среде.прощение споти определения следующим Изобретение относит и касается способов ид антигенов на поверхнос г антилимфоцитар Цель изобрете оба и повышение)х ан точно ос ествляе азом кой ови или како- органа выде- иенте фиколлжды отмывают (средой 199, иным физиолоИз периферичего-либо лимфоцит но ляют лимфоциты,верографина. Клеизотоническим расредой Хенкса, з ки дв творо буфер ОСУДАРСТВЕККЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(71) Белорусский научно-исследовательский институт переливания кровии Институт фотобиологии АН БССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИМФОЦИТАРНЫХ АНТИГЕНОВ И АНТИЛИМФОЦИТАРНЫХАНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ(57) Изобретение относится к медицине и может бь 1 ть использовано для выявления лимфоцитарных антигенов и антилимфоцитарных антител. Цель - упрощение повышения точности способа.Идентификация лимфоцитарных антигенови антилимфоцитарных антител осуществляется путем определения степени снижения времени жизни медленного компонентатриптофановой фосфоресценции при комнатной температуре(ТФКТ) лимфоцитов после их обработкитест-реагентом или исследуемым субстратом. Способ включает выделениелимфоцитов, их обработку исследуемойили стандартной сывороткой крови илииным субстратом, облучение образцов,из которых предварительно удален кис"лород, ультрафиолетовым светом в диапазоне 250-300 нм и определениеТФКТ. Снижение ТФКТ обработанных лимфоцитов на 87 и более свидетельствуето наличии тех или иных лимфоцитарныхантигенов или антилимфоцитарных антител. ическим раствором хлористого натрия)и готовят их взвесь с концентрацией(6-8)10 клеток в 1 мл (концентрация клеток зависит от чувствительности используемого Т-фосфориметра). К1 объему взвеси лимфоцитов добавляютравный объем исследуемого субстратаили тест-сыворотки (тест-сыворотка -реагент, содержащий антилимфоцитарные антитела определенной специфичности), Суспензию лимфоцитов перемешивают и инкубируют при 37 С 30 мин.По окончании инкубации клетки однократно отмывают изотоническим раствором и ресуспендируют в объеме 0,4 мл45 этого же раствора. В контрольную про" бу вносят иэотонический раствор,После удаления кислорода иэ суспензии лимфоцитов в образце воэбуж 5 дают триптофановую фосфоресценцию путем облучения в течение 3-5 с ультрафиолетовым светом спектрального диапазона 265-300 нм, после прекращения облучения регистрируют кинетику эату- О хания ТФКТ в цифровой или аналоговой формах, Путем обработки результатов регистрации кинетики затухания ТФКТ лимфоцитов опытной ( с,о)и контрольной ( м,к)проб определяют Г, и 7; и на основании сравнительного анализа полу ченных результатов (- : 87) определяют наличие лимфоцитарных анти-генов или антилимфоцитарных антител.П р и м е р 1. Иэ стабилизированной крови в градиенте плотности фиколл-верографина выделяют лимфоциты и дважды отмывают средой Хенкса. Готовят две порции взвеси лимфоцитов сконцентрацией клеток 810 в 1 мл. К 25 тестовой сыворотке анти-Н 1 Адобавляют равный объем взвеси лимфоцитов(опытная проба), Контрольным образцомслужат лимфоциты, проинкубированные в ,изотоническом растворе (растворе Хенк"30 са). После 30 мин инкубации при 37 С ,контрольный и опытный образцы одно кратно отмывают раствором Хенкса иосадок ресуспендируют в 0,4 мл раствора Хенкса (рН 7,2). Возбуждают триптофановую фосфоресценцию клеток путемоблучения ультрафиолетовым светом и с помощью Т-фосфориметра определяют время жизни триптофановой фосфоресценции контрольной и опытной проб лимГ40 фоцитов.я контрольного образца лимфоцитов равно 1,264 с, опытного - 0,822. Степень снижения времени жизни медленного компонента ТФКТ лимфоцитов 357,.Следовательно, на и"следованных лимфоцитах экспрессирован антигенН 1 А-А 10.П р и м е р 2. Иэ стабилизированной 2,77. ЭДТА цельной крови в градиенте феколл-верографина выделяют лимфоциты, которые после их двукратногоотмывания средой Хенкса делят на двепорции. К тестовой сыворотке антиН 1 А-В 41 добавляют равный объем взвеси55лимфоцитов с концентрацией 7 О в1 мл и после перемешивания инкубируют30 мин при 37 С. Контроль - лимфоциты, проинкубированные в растворе Хенкса. По истечении времени инкубации клетки однократно отмывают и переносят в 0,4 мл среды Хенкса. Определяют (с помощью-фосфориметра) время жиэ ни ТФКТ лимфоцитов контрольного и опытного образцов, Время жизнинеобработанных анти-Н 1 А сыворотки лимфоцитов равно 1,16 с, а обработанных 1,38 с, т.е, снизилось на 2 Е. Такое незначительное изменение времени жизни медленного компонента ТФКТ лимфоцитов после их обработки анти-НА тест-сывороткой свидетельствует об отсутствии на них антигена Н 1 А В 41.П р и м е р 3, Иэ стабилизированной 2,77 раствором ЭДТА цельной крови в градиенте фиколл-верографина выделяют лимфоциты. После их двукратного отмывания средой Хенкса готовят взвесь лимфоцитов в растворе Хенкса с концентрацией клеток 8 10 в 1 мл. К исследуемой тест-сыворотке добавляют равный объем взвеси лимфоцитов и после перемешивания.взвесь инкубируют 30 мин при 37 С. Контрольным образцом служат клетки, проинкубированные в растворе Хенкса. После инкубации оба образца однократно отмывают средой Хенкса. 0,4 мл клеточной взвеси используют для измерения параметров ТФКТ лимфоцитов, 6 контрольного образца лимфоцитов равно 1,177, опытного - 0,532. Следовательно, степень снижения Г обработанных лимфоцитов 54,87. Такое значительное уменьшение времени жизни медленного компонента ТФКТ лимфоцитов свидетельствует о наличии специфического взаимодействия между клетками и антилимфоцитарными антителами, т.е. о присутствии в исследуемом субстрате антилимфоцитарных антител.Формула изобретенияСпособ определения лимфоцитарных антигенов и антилимфоцитарных антител в сыворотке крови путем приготовления суспенэии лимфоцитов и обработки суспензии сывороткой крови, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и повышения точности определения, из суспензии лимфоцитов удаляют кислород, облучают ультрафиолетовым излучением в диа паэоне 265-300 нм, определяют время жизни медленного компонента триптоми ф р-- - -- 1007 Ъ 83м,к.- м о,н,г4 Фм,К Составитель Е.КолмаковаТехред Л.Олийнык Корректор Э.Лончакова Редактор Л,Веселовская Подписное Тираж 189 Заказ 8094/51 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,01 5 1532873 фановой фосфоресценции при комнатной где м.к температуре (ТФКТ) лимфоцитов и определяют наличие антигенов и антител1 ри время жизни медленного компонента ТФКТ лимфоцитов, необработанных сывороткой;время жизни медленного компонента ТФКТ лимфоцитов, обработанных сывороткой.