Способ иммуноферментного определения прогестерона в сыворотке крови человека и животных

РМЕНТНОГО ОПРЕД СЫВОРОТКЕ КРОВ или дианизи перекис зависим носится к акушеробам количественогестероца в сыво-,х и человека, каьной диагностики овочцои ию проезэ гест трак мик ати оличес ремя а за его лечением,ГОСУДАРСТВЕННЫИ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ ОПИСАНИЕ ИЗ К АВТОРСКОМУ(71) Институт биоормии АН БССР(56) Мипго С Б 1 аЬшеп 1 о а ппсгоС 11 гдпвпипоазвау ог ьпеоГ ргодезСегопе.1984, чо 1.1 о 1, И.1,(54) СПОСОБ ИММУНОФ ЛЕНИЯ ПРОГЕСТЕРОНА ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение от ству, точнее к спос ного определения пр ротке крови животнь сается дифференциал бесплодия и контрол наблюдения за протеканием беремеццос ти, выявления гинекологических заболеваний человека и животных и исследовательских целеи. Цель изобретения - сокращение времени анализа до3-4 ч и его упрощение. Для этого,предложен способ псевдогомогенногоиммуноферментного определения прогестерона в сыворотке крови человека иживотных, заключающийся в том, чтосвободный прогестероц и прогестероц,меченный пероксидазой хрена, ицкубируют с ацтителами к прогестероцу,добавляют к смеси полиэтиленгликоль6000 (ПЭГ 6000), центрифугируют и восадке определяют активность связанной пероксидазы по окислению ортоица перборатом натри ю водорода. По калиб сти находят коцентра а, Способ позволяет ным путем определять ва прогестерона и со ализа.Изобретение относится к способам ,количественного определения гесте-рона в сыворотке крови человека и животных и может быть использовано для дифференциальной диагностики бесплодия и контроля эа его лечением, наблюдения за протеканием беременности, выявления гинекологических заболеваний человека и животных и исследовательских целей.Цель изобретения - сокращение времени анализа до 3-4 ч и его упрощение.П р и м е р 1. Получение антисыворотки к прогестерону (Анти-ПРОГ).Получают коньюгат БСА-ПРОГ, растворяют 50 мг (0,72 мкмоль) БСА в 5 мл 0,1 М раствора ИаНСО (рН 8,35) и добавляют 25 мг (48,6 мкмоль) ПРОГ в 5 мл диметилформамида, Перемешиваютосмесь 20 ч при 20 С. Конечные концентрации добавленных веществ в растворе: БСА 6 мг/мл, ПРОГ 2,5 мг/мл, 50 об.диметилформамида. Непрореагировавшее производное прОгестерона удаляют диализом коцьюгата БСА-ПРОГ против дистиллированной воды до исчезновения в диализате поглощения прогестерона ца длине волны 250 цм. Количество связавшихся с БСА молекул прогестерона определяют ,.спектрофото. метрически, измеряя оптическую плотность раствора коньюгата на длинахволн 250 и 280 нм и используя при расчете коэффициент молярцой экстинк 4 -1 -1 ции прогестерона, равный 1,5 10 М см(21). В работе используют коньюгат БСА-ПРОГ, содержащий 35-40 молекулпрогестерона на 1 молекулу БСА.Антисыворотку к прогестерону получают многократной иммунизацией кроликов смесью общим объемом 1 мл, содержащей 1 мг коцьюгата БСА-ПРОГ, 0,5 млфизиологического раствора и 0,5 млполного адъюванта Фрейнда, по следующей схеме: 1-й месяц еженедельно,затем ежемесячно. Через 5-8 мес берут кровь на тестирование. Кровь берут на 7-10-й день после последнейиммунизации из краевой вены уха кроо лика, выдерживают ее при 37 С и 18 о20 ч при 4 С, центрифугированиемотделяют сыворотку и используют ее вдальнейшей работе.Проведение анализа.В пробирке, содержащей по 0,1 мл раствора прогестерона в забуференном физиологическом растворе (ЗФР 0,1 М КНРО, 0,15 М МаС 1, рН 7,4) с разными концентрациями от 10 до 1 О 9 М,добавляют 0,02 мл раствора коньюгатаПХ-ПРОГ в ЗФР с концентрацией 1,43 нМи 0,02 мл раствора антисыворотки кпрогестерону с разбавлением 1:60(конечное разбавление в инкубационной среде 1:420). Смесь инкубируюто10 60 мин и при 20 С. К смесям добавляют 0;28 мл 25 .-ного раствора ПЭГ6000 в ЭФР с рН 7,4 и спустя 20 минцентрифугируют смеси при 8000 об/минв течение 7 мин. Осадок отделяют и15 ресуспендируют в 2,8 мл цитратноацетатного буфера с рН 6,0, содержащего 0,34 М ортодиацизидина и 0,1 Твина 20, добавляют 0,2 мл того жебуфера, содержащего 1,07 мМ пербора 20 та натрия и в термостатированной кювете спектрофотометра "Бресо 1-20 Я(ГДР) регистрируот в течение 30 соптическую плотцость раствора при460 нм. Расчитывают начальную скорость реакции окисления ортодианизидина (о-ДА) для каждой из систем, содержащих разцые концентрации прогестероца. Строят калибровочную зависимость в координатах начальная скорость реакции - логарифм концентрации прогестероца.,Аналогично описанному обрабатывают смеси, содержащие неизвестные концентрации прогестерона, и после вы 35 числения начальных скоростей окисления о-ДА по калибровочной зависимости определяют концентрацию прогестерона в пробе. Способ анализа позволяет определять прогестерон в интер 40 вале концентраций 10 -10 Г 1.П р и м е р 2. Антисыворотку кпрогестерону получают аналогично примеру 1, В пробирки, содержащие по0,1 мл растворов в ЗФР прогестерона45 с разными концентрациями, добавляют0,02 мл раствора ацтисыворотки к прогестероцу в ЗФР с конечным раэбавлением 1:252 и выдерживают смеси 1 чпри 20 С, Затем во все пробирки добавляют по 0,02 мл раствора коньюгата ПРОГ-ПХ в ЗФР с концентрацией33,0 цМ (конечная концентрация4,7 цМ) и ицкубируют смеси еще 1 чпри той же температуре. Во все про 55 бирки добавляют ло 0,28 мл раствораПЭГ 6000 в ЗФР с концентрацией 25(конечная концентрация 16,66 ) и инокубируют смеси 20 мин при 20 С, после чего центрифугируют их при1381402 10 Способ иммуноферментного определения прогестерона в сыворотке кровичеловека и животных путем инкубирования свободного прогестероиа и прогестерона, меченого пероксидазой хрена, с антителами к прогестерону, разделения свободной и связанной форм и последующего определения концентрации прогестерона по активности пероксидазы хрена, о т л и ч а ю - . щ и й с я тем, что, с целью сокращения времени определения, инкубирование прогестерона с антителами к нему проводят в растворе, а для разделения связавшихся и несвяэавшихся с антителами антигенов используют полиэтиленгликоль 6000. ВНИИПИ Заказ 18/40 Тираж 847 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 8000 об/мин в течение 7 мин, Супернатант удаляют, осадок растворяют,добавляя 2,8 мл цитратно-ацетатногобуфера с рН 6,0, содержащего О, вес,7.Твин 20, затем в системы добавляют0,1 мл раствора (о-ДА) в диметилформамиде (ДМФ) до концентрации 0,4 мМи 0,1 мл раствора пербората натриядо концентрации 1,0 мМ и при 20 Св кювете спектрофотометра регистрируют в течение 30 с изменение оптических плотностей раствора. Вычисляют значения начальных скоростей окисления о-ДА во всех системах и делят 15на величину начальной скорости реакции окисления о-ДА в контрольнойсистеме, не содержащей прогестерона.Строят калибровочную зависимостьотносительная скорость окисления 20о-ДА в 7 к контрольной - логарифмконцентрации прогестерона.Аналогично обрабатывают смеси,содержащие неизвестные концентрациипрогестерона в растворах, и после 25вычисления начальных скоростей окисления о-ДА в 7, к контрольной определяют искомые концентрации прогестерона по калибровочной зависимости.Предлагаемый способ анализа позволяет 30определять прогестерон в интервалеконцентраций 10 -10 моль/л.П р и м е р 3. В пробирки, содержащие 0,05 мл человеческой сывороткис нулевой концентрацией прогестеронадобавляют 0,05 мл растворов прогестерона в ЗФР с разными концентрациямиот 3 О до 1,21 О М и по 002 млраствора антисыворотки к прогестерону в ЗФР с конечным разбавлением 401:532 и выдерживают смесич прио20 С. Затем во все пробирки добавляют 0,02 мл раствора коньюгата ПХ-ПРОГв ЗФР с концентрацией 33,0 нМ (конечная концентрация 4,71 нМ) и инкубируют смеси еще 1 ч при той же температуре, Во все пробирки добавляют0,28 мл раствора ПЭГ 6000 в ЗФР сконцентрацией 257 (конечная концентрация 16,667.) и инкубируют смесио,20 мин при 20 С, после чего центрифугируют их при .8000 об/мин в течение 7 мин. Супернатант удаляют, осадок растворяют, добавляя 2,8 мл цитратно-ацетатного буфера с рН 6,0, содержащего 0,1 вес.7 Твина 20, затем в системы добавляют 0,1 мл раствора о-ДА в ДМФ до концентрации 0,4 мМ и 0,1 мл раствора пербората натрия до концентрации 1,0 мМ, и прио20 С в кювете спектрофотометра регистрируют в течение 30 с изменение оптических плотностей растворов, Вычисляют значения начальных скоростей окисления о-ДА во всех системах.Строят калибровочную зависимость начальная скорость окисления о-ДА - логарифм концентрации прогестерона.Предлагаемым способом анализа можно определять прогестерон в интерва-9ле концентраций О -1 О моль/л,Предложенный способ иммуноферментного определения прогестерона в сыворотке крови позволяет безэкстракционцым путем определять микроколичества прогестерона и сократить время анализа до 2 ч при конкуретной схеме его проведения и до 3 ч при проведении анализа по схеме с поздним добавлением меченого пероксидазой прогестерона. При этом достигается чувствительность до 10 моль/л. Формула и э о б р е т е н и я