Способ получения реагента для диагностики фитопатогенных бактерий рsеudомоnаs syringae 1 9 серогрупп

(56) Микробиологичесс.222-229. ственный Институт . Д.К.Забо Вихоть, А .И,Гвоздя ситетиолоо униве микро лотно Е,Вер щиго А.М к и й журнал. 1979, ВЗ,Изобрет хозяйственн иммунохим идентификац Р,зугпдае,Цель изо вительности Способ ности ки ф Рзеобоеопа ющем.ю сыворотку к готовят путем в равных объек, полученныхаммами, приппам по следунизируют взвесью жиклеток в 0,15 М раствоия с нагрузкой 1-я кл./мл, 2-я инъекция -У ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАГЕНТА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ РЯЕОООМОИАЯ ЗУВИОАЕ 1 - 9 СЕРО ГРУПП(57) Изобретение относится к сельскохозяйственной биологии, в частности к иммунохимическим методам экспресс- идентификации фитопатогенных бактерий Рзецдоеопаз зугпдае, Целью изобретения является повышение чувствительности реагента. Способ получения реагента для диагностики фитопатогенных бактерий ение относится к сельскоой биологии, в частности к ческим методам экспрессии фитопатогенных бактерий бретения - повышение чувстреагента.получения реагента для диагитопатогенных бактерий з зугпдае заключается в след 1665307 А 1 Рзеобоаопав зугпдае заключается в следующем, Иммунную поливалентную сыворотку к 1-9 серогруппам Р. зугпдае готовят путем механического смешивания в равных объемах серогрупповых сывороток, полученных иммунизацией кроликов штаммами, принадлежащими к 1 - 9 серогруппе.Титр полученных антисывороток 1;25600 - 1:52200, Корпускулярную суспензию Ятарйуососсоз авгевз шт. Соцчапготовят путем культивирования стафилококка на мясопептонном агаре при 37 С в течение 12 - 18 ч, отделения биомассы от среды, инактивации ее при 80 С 1 ч, отмывания и обработки 50-ным раствором этанола в течение 30 мин при 37 С, Реагент готовят коньюгацией сыворотки с суспензией ста- ф филококка при 37 С в течение 30 мин с последующей отмывкой не присоединившихся к белку А балластных веществ. Соотношение сыворотки и суспензии при приготовлении реагента 1:5 - 1:20. Способ позволяет получить более чувствительный реагент к антигенам Рге 0 бовопаз зугпдае 1 - 9 серогрупп. 6 табл.юг Иммунную поливалентну1 - 9 серогруппам Р.зугпдаемеханического смешиваниямах серогрупповых сыворотоиммунизацией кроликов штнадлежащими к 1-9 серогрующей схеме.Кроликов иммувых бактериальныхре хлорида натринъекция - 500 млн1 млрд кл,/мл, 3-я инъекция - 2 млрд кл./мл,4-я инъекция - 3 млрд кл,/мл. Интервалы между иньекциями 5 дн, Забор крови через 11 - 13 дн, после инъекций, Титры полученных антисывороток 1;25600- 1:52200.Корпускулярную суспензию ЗтарЬу 1 ососсцз аогецз шт. Соаапготовят путем культивирования стафилококка на мясопептонном агаре при 37 С в течение 12 - 18 ч, отделения биомассы от среды, инактивации ее при 80 С 1 ч, отмывания и обработки 50;-ным раствором этанола в течение 30 мин при 37 С.Конь.огацию сыворотки с суспензиейопроводят при 37 С в течение 30 мин с после- дующей отмывкой не присоединившихся к белку А балластных веществ. Соотношение сыворотки и суспензии при приготовлении реагента 1:5 - 1;20. Обработка только нагреванием не обеспечивает необходимой активности и стабильности белок А содержащих клеток. О наличии активного белка А на стафилококковых клетках после различных процедур приготовления стафилококковой суспензии судят по способности корпускул стафилококка агглютинировать эритроциты, сенсибилизированные иммуноглобулинами в реакции непрямой гемагглютинации, а также непосредственно в процессе определения антигенов Р,зуг 1 пдае. При постановке реакции непрямой гемагглютинации в ряд лунок микро- планшет вносят последовательности разведения взвеси стафилококка (0,05 мл) и 0,05 мл эритроцитарного диагностикума, представляющего собой тонизированные эритроциты, обработанные кроличьей сывороткой(титр 1:12.800). Установлено, что максимальное разведение стафилококковой суспензии, при котором наблюдается отчетливая агглютинация сенсибилизированных эритроцитов, 1 10 кл./мл. Для стафилокок 5ка, обработанного известным способом - формалином 1 10 кл./мл, отсутствие активности для стафилококка, обработанного лишь нагреванием, при постановке реакции через 24 ч и более после приготовления стафилококковой суспензии.Разрушение протеолитических ферментов, инактивация стафилококка, закрепление на его поверхности активного в иммунологическом отношении белка А происходит при нагревании при 80 С 1 ч в сочетании с обработкой 50(-ным раствором этанола. При более низкой, чем 80 С, температуре факторы патогенности стафилококка не инактивируются в течение 1 ч, при более высокой температуре наблюдается экстракция белка А, разрушение клеток, что естественно влияет на качество реагента.16-18-часовая агаровая культура стафи 5 лококка применяется в связи с тем, что, используя для получения биомассы жидкиепитательные среды (МПБ и пептонно-дрожжевую среду), был получен меньший выходбиомассы на одинаковый объем питатель 10 ной среды. При сокращении времени культивирования до 12-14 ч значительноуменьшается выход биомассы, а при увеличении до 20 - 48 ч наблюдаются потери активного белка А, который, видимо,15 подвергается действию протеолитическихферментов.51 арЬуососсаз авгеоз шт. Соцчалполучен из Чехословацкой коллекции микроорганизмов, в клеточной стенке этого штамма20 содержится большее количество клеточносвязанного белка А по сравнению со штаммом АТСС 12598.Реагент не снижает свою активностьпри хранении при 4 С 2 мес, а его составная25 часть - суспензия клеток стафилококка - до5. Активность реагента сохраняется в течение 1 года при хранении при 4 С, а егосоставной части - суспензии клеток стафилококка - более 1 года,30 П р и м е р 1. Реагент для экспресс-индикации антигенов Р, Яуг 1 пдае получаютследующим путем: стабильную инактивированную и активную по белку А суспензиюзолотистого стафилакокка штамма Соаап 35 как составную часть реагента получают прогреванием 12-18-часовой агаровой культуры стафилококка, смытый физиологическимраствором; тепловой обработки при 80 С1 ч, отмывают центрифугированием при 340 тыс. об/мин 15 мин, после чего обрабатывают осажденные и убитые клетки 50-нымраствором этанола с целью стабилизацииклеток и белка А. Обработку этанслом продолжают 30 мин при 370 С. Заем клетки45 снова осаждают, отмывают физиологическим раствором, доводят концентрацию до10 и хранят при 40 С с добавлением мертиолята или азида натрия более 1 года безпотери активности,50 Для сенсибилизации стафилококка антисывороткой к 10-ной суспензии стафилококка вносят поливалентную сыворотку кРзеодовопаз зуг 1 пдае из расчета 0,1 мл сыворотки на 1 мл 10(,-ной клеточной суспен 55 зии стафилококка. После 30-минутногоинкубирования при 370 С не связавшиеся сбелком А иммуноглобулины удаляют путемцентрифугирования при 3 тыс. об./мин15 мин. Осадок ресуспендируют в физиологическом растворе до 1 - 5-ной концентра 1665307ции, Приготовленный таким образом реагент для экспресс-индикации антигенов Р.зугпдае хранится при 4 С в течение 1 года без потери активности.П р и м е р 2. Для экспресс-индикации 5 антигенов Р,зуг 1 пдае на обработанное этанолом стекло пипеткой наносят 0,025 мл (1 капля) реэгента для экспресс-индикации антигенов Р.зуг 1 пдае и 0,05 мл (2 капли) суспенэии клеток исследуемых бактерий в кон центрации 1 10 кл/мл. Результат учитывают в течение 1 мин (табл.1). Как видно из табл.1, корпускулярные антигены исследованных штаммов представителей всех серогрупп вида Р, зуг 1 пдае по класси фикационной схеме Пастушенко Л.ТСимонович И.Д. взаимодействовали с реагентом для экспресс-индикации антигенов Р,ыг 1 пдае, Антигены бактерий других видов и родов с полученным реагентом давали от рицательный результат, что говорит о высокой специфичности реагента в отношении антигенов Р.зуг 1 пдае.П р и м е р 3. Влияние концентрации стафилококковой суспензии и ее соот ношение с антисывороткой, используемые при приготовлении реагента на чувствительность реакции реэгента с антигенами Р.зуг 1 пдае. Эти данные приведены в табл,2 и 3. 30Использование 157.-ной взвеси стэфилококка затрудняет учет реакции в результате высокой густоты суспензии при визуальной оценке наиболее четко реакция проявляется при использовании 10-ной 35 суспензии стафилококка, Таким образом, 100 -ная суспензия стафилококка является оптимальной при визуальном учете.Как видно из табл.3, оптимальным соотношением сыворотки и суспензии стэфило кокка является 1:10.П р им е р 4. Сравнение активности реагента. полученного по известному способу (с применением формальдегида), с предложенным, Получение реэгента и по становка реакций агглютинации проводилась так, как было описано ранее. Для сравнения использовали стафилококковую суспензию, фиксированную раствором формальдегида 0,5 - 3 ч, отмытую и прогретую 50 при 80 С 1 ч, и приготовленную предложенным способом. При обработке микробной массы стафилококка формальдегидом положительная реакция наблюдалась при концентрации 1 10 кл/мл, оценивался на 2+ и 55 учет реакции проводилась через 40 - 50 мин после ее постановки, При меньших концентрациях антиген Р.зуг 1 пдае не выявлялся. Та же биомасса, термообработанная и входящая затем в состав реагента, опрейте ляла тот же антиген в концентрациях 1 10 - 1 10 кл/мл в течение 30 с - 15 минреакция при этом оценивалась на 4+.П р и м е р 5. Сравнительные данные способов приготовления стафилококковой суспенэии и сорбции поливалентной сыворотки к Р.зуг 1 пдае. Сорбционную емкость определяли как количество мг белка сыворотки, сорбировавшегося на клетках стафилококка, и выражали в процентах по отношению к концентрации белков сыворотки, Данные представлены в табл. 4-6.Как видно иэ табл.4, чем меньше Сроки культивирования 51 эрЬу 1 ососсоз аогецз шт, Союап-, тем большей сорбционной емкостью в отношении иммуноглобулинов поливалентной сыворотки к Р.зуг 1 пдае обладают его клетки, Но культивировать стафилококк менее 12 ч нецелесообразно, так как значительно понижается выход биомассы, это неудобно также методически, Целесообразно культивировать стафилококк с целью получения специфического реагента 12 - 18 ч, считая оптимальным время культивирования 14 - 16 ч,Как видно из табл. 5, наибольшей сорбционной емкостью обладает стафилококк, прогретый при 80 С. Хотя сорбционная емкость такого стафилококка ниже по сравнению с сорбционной емкостью живой культуры, но работать с такой биомассой более безопасно, кроме того, можно хранить более длительное время без потери активности, так как инактивируются протеолитические ферменты.Для более полной инактивэции стафилококков, а также с целью увеличения срока сохранения активности в связи со стабилизацией клеток и закрепления на их поверхности белка А, прогретую биомассу дополнительно обрабатывали этанолом разной концентрации (табл.5).Таким образом способ позволяет получить более чувствительный реагент к анти- генам Р.зуг 1 пдае 1-9 серогрупп.Формула изобретенияСпособ получения реагента для диагностики фитопатогенных бактерий Рзеадопопаз зуг 1 пдае 1 - 9 серогрупп, включающий приготовление кроличьей поливалентной иммунной сыворотки к указанным бактериям,отл и ча ю щи й с ятем, что,с целью повышения чувствительности реэгентэ, поливалентную сыворотку смешивают в соотношении 1:5-1:20 с 5-10-ной агаровой суспензией Я 1 арпу 1 ососсцз аогецз1665307 Соаап, инактивированной при 80 С в тече С, смесь инкубируют при 37 С в течение ние одного часа и обработанной 50-ным 30 мин и отмывают неприсоединившиеся к раствором этанола в течение 30 мин при белку А балластные вещества. Таблица Индикация корпускулярных антигенов Р. Бугдп 8 аес помощью реагента для экспресс-индикации антигенов Р. Яугх 1 щае Штамм Серо- Реэультат группа реакции Внд 181 281 К11 467 РП 1 4394 1 Ч 7923 1 Ч 948 Ч 1 2399 7842 Ч 1 8299 Ч 1 223 Ч 11 ЧП 1225 7595 1 Х 9048 Р. а 1 айю 1 рча 11 со 1 а 89 Р. аегц 81 поваЕ. со 11 П р и м е ч а н и е: - отсутствие реакцни;положительная реакция на 4 плюса по общепринятой оценке. Р. Яугдпяае Р. Яугпщае Р. Яугхп 8 ае Р. Бугдпяае Р. Яуг 1 п 8 ае Р. ЯугЫяае Р. Яугыяае Р. Яугпаае Р. Яугхпяае Р, ЯугЫ 8 ае Р. Яугдпяае Р. Яуг 1 п 8 ае Р. Яуг 1 п 8 ае Р. Яугдпкае Р. схсЬогхд1665307 Таблица 2 Зависим)сть чувствительности реакции от концентрации стафилокохковой суспензии приприготовлении реагента Концентрация стафилококковой ШтаммР. Яуг 1 п 8 а суспензии 1 й 52 1 ОХ 1 1 Оз 1 1 О+ Таблица 3 авнсимост чувствительности реакции (1 ОХ) суспензин при т соотношения сыворотки ириготовленнн реагсит афилококсовой Соотноше пензи таммБуг 1 о 8 а оротки афилококково+ Таблиц бционная емкость Х рема куль ования, ч и 4,7,10 12 85,15 .77,68"76,5275,30 0 28179234394 Определение сор бциои суспензии зивых клет ацгепв шт, Соиапв лентной антисыворотк ой емкк Ясотношек Р. ости 1 ОХ-ной рЬу 1 ососсов нии поливаЯуг 1 п 8 ае1665307 Таблица 6 Определение.сбрбциоиной емкости 102-нойинактивированной нагреванием и обраббтанной этанолом равной концентрациисуспенэии Бсерьу 1 ососсцв вцгецвщт, Сочап а отношении полиаелентноЯантисыаоротки к Р. 8 ут 1 п 8 аеТемпература, Сф Концентрация этанола Сорбционная емкость3 орбционная емкост3 60 57,77 5874 4 70 73,30 65,53 50 Составитель Ю.РогачевРедактор В.Данко Техред М.Моргентал Корректор И.Мус Заказ 2389 Тираж 419 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 10 Таблица 5 Определение сорбционной емкости 103-ной ииактинироаанной в равнык температурных реаимах суспенвии йтаппу 1 ососсцв ацгецв щт. Соиапв отношении полиаалеитной антисыворотки к Р.Зут 1 п 8 ае 57,7 61,6 66,0 65,5