Способ получения пептидов

(19) ИЕ И БРЕТ О К ПАТЕН 1.ецг 8У - Гили К жет ель ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТПРИ ГКНТ СССР(71) Дэе Салк Институт фор Биолоджикал Стадиэ ЖБ)(72) Вили Уолкер Гейл-младщийи Жан Эдуард фредерик Ривье (СН)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается пептидов, в частности получения соединений общей ф-лы 1: Г,-К -Лвр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-Ка-Бег-Г; 1 о Агр-Г. г-Г З-Г, - -С 1 у-С 1 п-Ьец-Гв -А 1 а-Лгр-Ьув-Ьец-К 4-Кг-Г -Г 11 е-Кгв-Гл -т, где К(-Туг, Н 1 в Гг - Л 1 а 1 ЩЩЛ; Гв Бег, Авп; К о - Туг, 0-Туг; К, Агд, Ьув; К, - 11 е, Ча 1; Г.1 - Э-Ьец, Ьец; К,8 - Туг, Бег; Кг Н 1 в, С 1 п; Кг - С 1 п, Авр; Г гв - 11 е;Авп, Бег; Г г - Лгд, Р-Лгр;1 Н , ИНСАН, при условии, чтог - ИЖЛ, или Г 14 = Р Ьец, или Кг - О-Агр, которые способны вызывать секрецию природного гормона роста, что мо быть использовано в медицине, Ц - создание новых 1) 4 С 07 К 7/10 //Л 61 К 37/О более активных пептидов. Их синтез ведут иэ Вос-Агр(Тов) или Вос- -Агр(Тов), который связывают с полимерной смолой ИВЯА или Г 11.АМ с последующим отщеплением Вос-защитной группы. Затем проводят постепенное наращивание пептидной цепи в последовательности, укаэанной в ф-ле 1 Ц . Полученный пептидилполимер общей ф-лы (113: Х,-К, (Х или Х )-Г -Авр(Х)- -А 1 ае-РЬ е-ТЬ г (Х ) -К(Хили Х ) - -Бег(Х 4) -К 1 о (Уг) -АгД (Хв) -Ка (Хв или Хт)-К 1 -Кщ -С 1 у-С 1 п(Х )-Ьец-Ке (Х. )- -А 1 а-Агр (Хв ) -Ьув (Хт) -Ьец-Ьец-Г г 4 (Х или Х)-Кгв(Х)-11 ее-Кгв (Х+ или Х)-К (Х)-Х, где Х - тоэил, Х, - с Вос; Хг - 2,6-дихлорбензил, Х - ОВг 1; Х Г - бензиловый эфир, Хксантил, Хв - тозил, Хт - 2-хлорбенэилоксикарбонил, Х - смола-носитель С МВНА или Г 1 ЕАМ, подвергают деблокированию и отщеплению пептида от смолы- носителя с использованием фтористого водорода в сочетании с аниэолом или метилэтилсульфидом, или их смесью,в качестве акцептора при температуре от 0 до (-20)о С с последующим растворением полученного продукта в уксусной кислоте и очисткой, например, тонким фильтрованием через гель сефадекс С. Новые пептиды оказывают 1 влияние на секрецию гипофизарных желез, что можно использовать для промотирования роста животных или в диагностической практике. 1 табл.30097 4 МеОН (дважды) 0,5 50 Время смешивания,55мин 0 СС 1ВОС - аминокислота 50-90 Изобретение относится к спосоЬуполучения пептидов - новых биологически активных соединений, которыемогут найти применение в медицине.Цель изобретения - способ получения новых соединений в ряду пептидов, малотоксичных и обладающих более высокой эффективностью в отношении стимулирования выделения гипофизом гормона роста.П р и м е р 1, Синтез пептида0-Г 1 МА,Г 11 е 3 -гСЕГ(1-29)-Г 1 Н имеющего следующую формулу: Н-Н 1 в-Г 1 МА-Азр-А 1 ае-Рпе-ТЬг-Бег-Бег-Туг-Агд-Агре-Ьец-С 1 у-С 1 п-Ьеи-Туг-А 1 а-АгВ-.ув-Ьеи-Ьец-Н 1 в-С 1 це-Г 11 е-Аьп-Агд-Г 12осуществляют последовательно сприменением пептидного синтеэато"ра Бекман 990 на смоле МВНА,имеющей интервал замещения около 0,1-0,5 ммоль/г смолы. Связывание Вас-Агд(ТоБ) со смолой осуществляют обычным способом с использованием смеси хлористого метилена иДМФ при температуре около 60 С, втечение 21 ч при перемешивании с использованием 2 г смолы и 2 ммолейАг и получают замещение около0,35 ммолей Агр на 1 г смолы.После деблокирования и нейтрализации пептидная связь постепенно образуется на смоле, Деблокирование,нейтрализацию и прибавление каждойаминокислоты проводят обычным способом. Все растворители, которые применяют, тщательно дегазируют посредством продувки инертным газом, например, гелием или азотом,Деблокирование предпочтительнопроводят согласно режиму А;Реагент Время смешивания,мин601 ТГА /2 этандитиол 10600 ТГА /2 Этандитиол 151 РА /11 этандитиол 0,5Кг Г (1 ОЖ) в СН С 1 0,5МеОН о,5Ег Г (1 О ) в СНС 1 0,5Г 1 еОН (дважды) 0,5СН С 1 (дважды) 0,5Сочетания предпочтительно проводили согласно режиму В:Реагент 10 15 20 25 30 35 40 45 СНС 1 г (дважды) 0,5АСО (3 М) в СН С 1 15,0С 1 о,5МеОН 0,5СН С 1 (дважды) 0,5В общем от 1 до 2 ммоль аминокислоты, защищенной ВОС, (трет-бутокси"карбонил), в хлористом метилене, ДМФили их смеси, применяют на 1 г смолыплюс один эквивалент 1,0 моль 0 СС 1(Г 1,Г 1-дициклогексилкарбодиимида) вхлористом метилене в течение 2 ц.При сочетании ВОС-Агв (ТоБ) применяют смесь 500 МГ (диметилформамид) ихлористый метилен, Эфир В 21 применяют как группу, защищающую гидроксилбоковой цепи для защиты Бег(серин)и ТЬг (треонин), Амидогруппу Авп(аспарагин) или С 1 п (глютамин) защищают ксантилом (Хап), когда применяют предпочтительную связь 0 СС (Г 1,Г -дициклогексилкарбодиимид). Можнотакже применять Р-нитрофениловыйсложный эфир (ОГр) для активированияконцевой карбоксильной группы Аепили С 1 п и, например, можно связыватьВОС-Азп (ОГр) в течение ночи, применяя один эквивалент НОВС в 501-нойсмеси диметилформамида (0 ИГ) и хлористого метилена, причем в этом случае 0 СС не добавляют, Для защиты Ьув(лизин) с боковой цепью применяют2-хлор-бензилоксикарбонил-(2 С 1-2)Товприменяют для защиты гуанидиновойгруппы Агр и имидазольный азот Ндв,карбоксильную группу в боковой цепиС 1 п или Азр защищают ОВ 21. Фенольнуюгидроксильную группу защищает 2,6-дихлорбенэил (0 СВ), В конце синтеза по.лучают следующий состав: Вос-Ндв-ЯМА-Авр(Х)-А 1 ае-РЬе-ТЪг(Х 4,)- .-Агв(Х 4)-Пе-Ьео-С 1 у-С 1 п(Ху)-Ьец-Туг(Х.,)-А 1 а-Агц(Х 4)-Ьув(Хт)-Ьеи-Ьео-Н 1 з-С 1 п(Х)-11 е-К 1 е-Авп(Х)-АЯ(Х 4)МВНА, где Х - 0 СВ (2,6где Х - 0 СВ (2,6-дихлорбензил),Х - ОВ 21;Х+ - В 2 (дибензиловый эфир),Х- Хап,Хб - ТоБ;Х 7 - 2 С 1-2. Хап (ксантил) можно частично или полностью удалять посредством обработки с ТГА, применяемой для деблокирования группы защиты о(, -аминокислоты,5 15для отделения и снятия защиты с защищенного пептида на смоле его обрабатывают 1,5 мл аниэола, 0,5 мл метилэтилсульфида и 15 мл Фтористого водорода на 1 г пептида-смолы при 0 С в течение 30 минПосле удаления фтористого водорода в условиях высокого вакуума остаток из смолы и пептида попеременно промывают сухим диэтиловым эфиром и хлороформом и затем пептид извлекают с помощью дегаэированной 2 н, водной уксусной кислоты и отделяют от смолы путем фильтрованияПосле этого отделенный пептид, освобожденный от защиты, растворяют в 0-54-ной уксусной кислоте и подвергают очистке, которая может включать тонкое фильтрование через гель сефадекс С.Затем пептир дальше очищают посредством препаративной или полупрепаративной НРЬС. Патроны, снабженные составом ЬСфирмы Уотера Рссосиэйтз, набивают 15-20 мг кремнеземом С от Чус 1 ас (300 Л). Градиент СН С 1 в ТЕАР создается устройством низкого давления Е 1 сех 1,гад 1 епг. валет. Хроматографические Фракции тщательно контролируют посредством НРЬС, причем собирают только Фракции показывающие значительную чистоту; Обессоливание очищенных Фракций, отдельно проведенных на чистоту, достигается при применении градиента СН СИ в 0,.14 ТРА (трифторуксусной кислоте). Затем вырезанную центральную часть лиофилизируют для получения требуемого пейтида чистотой свыше 983.Получают 74,2 мг пептида, имеющего амидированный конец С цепи, с выходом около 53 от количества отщепленного пептида. П р и м е р 2. Синтез пептида 1 Р-МИА,Бег ф,11 е-гСКГ(1-29)-БН имеющий формулу: Н-Н 1 я-Р-ИИА-Авр-А 1 ае - РЬе-ТЬг-Бег в Б-Туг-Лгв-Агр,-Пе" -Ьец-С 1 у-С 1 п,ец-Бег-А 1 а-Лгв-Ьуя-Ьец- -1,ец-Нгя-С 1 пее-Авп-Агд-ИИ, проводят постепенно в синтезаторе Бекман 990 на смоле 1 ВНЛ, аналогично примеру 1, При применении Т 1.С с НРЬС получают очень чистый пептид.П р и м е р 3. Синтез ЬСЕР - аналогового фрагмента .Р-ЯА,111 е 3 - -ЬСКР(1-29)-Л 1, имеющего формулу: Н-Туг-Р-АИЛ-Ляр-А 1 ае-ГЬе-ТЬг-Авп-Бег-Туг-Лгд,уя-ча 1-Ьец - Г 1 у-Г 1 п-Ьец 300976 5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55-Бег-Л 1 а-Лтд-Ьу в,ец-Ьец-Г 1 л-Ляре-И 1 е-Бег-АгдЛапроводят постепенно в синтезаторедля пептидов типа Бекман 990 на смоле МВНА согласно примеру 2,Применяя Т 1.С (тонкослойную хроматографию) и НГЬС, устанавливают, чтополучают практически чистый пептид.П р и м е р 4. Синтез части аналога ЬСКРГО-ИИА,Яет,Р-ЛгиЯ -ЬГГГ(1-29)-ЛН, имеющего формулу;Н-Туг-РЧИА-Аяр-Л 14-11 е-РЬе-ТЬг-Авп-Бег-Тут-Ат-Ьуяа 1-Ьец-Г 1 у-С 1 п-Ьец-Бег-А 1 а-Агв-Ьуя-Ьец-Ьецп-Авре-М 1 е-Бег-Р-Лг 1 -1 Лпроводят последовательно в синтезаторе Бекман 990 для синтеза пептидана смоле ИВНА аналогична примеру 1,При применении ТЬС и НГЬС получаютпрактически чистый пептид,П р и м е р 5. Синтез С Р-Ьец14И 1 е 3-гСВР(1-29) -1 Л 1, имеющего Фор 2 тмулу:Н-Н 1 я-А 1 а-Аяр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-Бег-Бег-Тут-Агв-Агуе-Р-Ьец-С 1 у-С 1 п --Ьец-Туг-А 1 а-Лгв-Ьуя-Ьец-Ьец-Ндя-С 1 пе-Й 1 е-Аяп-АгдЛ 1проводят последовательно в синтезаторе Бекман 990 для синтеза пептидовна смоле ИВА, как в примере 1, Приприменении Т 1.С и НРЬС получают практически чистый пептид.П р и м е р 6. Синтез " Р-ЛЛ,И 1 ет,Аяп 3-ЬСЕР-(1-29)-1 Лв, имеющего формулу:Н-Туг-Р-ИМА-Ляр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-Аяп-Бег-Туг-Агд-Ьуя-Ча 1-Ьец-С 1 у-С 1 п-Ьец-Бег-А 1 а-Лгв-Ьув-Ьец-Ьец-С 1 п-Аяре-И 1 е-А вп-АгдЛпроводят последовательно в пептидномсинтезаторе Бекман 990 на смоле МВНЛ,как в примере 1. Пептид оценен какпрактически чистый, применяя ТЬС иНР 1.С,П р и м е р 7. Синтез И 1 еР-Агв Ъ -гСГГ(1-29) -ГЛ 1, имеющегоформулу:Н-Н 1 я-А 1 а-Аяр - А 1 ае-РЬе-ТЬг-Бег-Бег-Туг-Агр-АгГе-Ьец-С 1 у-С 1 п-Ьец-Туг-А 1 а-Агв,уя,ец,ец-Н дя-С 1 пе-Ь 1 е-Дяп-Р-Агр-%1проводят постепенно в синтезатореБекман 990 на смоле МВ 1 А, как в примере 1, По данным Т 1,С и НРЬС, получается практически чистый пептид.П р и м е р 8, Синтез аналоговогоЬСВР фрагмента Р-ЛЛ,Р-ТугМ 1 е "1-ЬОКР(1-29)-ГЛ, имеющего Формулу:Н-Туг-ВА"Авр-А 1 ае-РЬе-ТЬг" -Аяп-Бег-Туг-Агр-ЬувЧа 1-Ьец-С 1 у-С 1 п-Ьец-Бег-А 1 а-Агр-Ьув-Ьец-Ьец-С 1 п-Аяре-И 1 е-Бег-Аг-ИНй 5 проводят. постепенно в синтезаторе Бекман 990 на смоле ИВНА, как в примере 1. При применении ТЬС и НРЬС получают в основном чистый пептид.П р и м е р 9, Синтез аналогового ЬСКГ фрагмента Э-ЯА,Б 1 е .3 -ЬСЕГ (1-29)-БНЕс, имеющего следующую формулу:Н-Туг-РМЛ-Авр-А 1 ае-РЬе-ТЬт-Аяп-Бег-Тут-Лгд-Ьув-Ча 1-Ьец-С 1 у-С 1 п -Ьец-Бег-А 1 а-Агр-Ьув-Ьец-Ьец-С 1 п-Авре-И 1 е-Бег-АгаПС 1 СН эосуществляют последовательно в пептидном синтезаторе Бекман 990 на -алкиламиновой смоле, называемой также Б-этиламинометиловой смолой (смолой ЯЕАМ). Приблизительно 1 О г 1 сшитой хлорметилированной поли стирольной смолы вводят в реакцию с 50 мл этиламина при температуре окооло 4 С в течение приблизительно 36 ч при непрерывном перемешивании для замены хлорбензильных групп на Б-этиламинобензильные группы и после завершения реакции несколько раз промывают метанолом и водой. Затем на первоначальной замещенной амидной связи синтезируют пептид. После получения нужной рептидной последовательности проводят снятие защиты и отщепление от смолы обработкой фтористоводородной кислотой с анизолом в качестве акцептора, проводя сначала пе 1 оремешивание.при 0 С, а затем оставляя смесь медленно нагреваться при .пере мешивании до комнатной температуры в течение приблизительно 3 ч, при этом пептид отщепляют от смолы в виде этиламида, По данным ТЬС и НРЬС получают практически чистый пептид.45П р и м е р 10, Синтез О-ИИА, Б 1 е ",Аяп 51 ЬСКР(1-29) -ЯЕс имеющего следующую формулу:Н-Туг-МА-Аяр-А 1 ае-РЬе-ТЬт-Ляп-Бег-Туг-Ага-Ьуя-Ча 1"Ьец-С 1 у-С 1 п -Ьец-Бег-А 1 а-Ате-Ьув-Ьец-Ьец-С 1 п-Аяре-И 1 е-Ляп-ЛтдНС СНяпроводят последовательно с использованием пептидного синтезатора Бекман 990 на смоле ХЕЛМ аналогично приме ру 9. По данным ТЬС и НРЬС этот аналоговый пептид является практически чистым. П р и м е р 11,Синтез аналогового ПСНР фрагментаН 1 в ,Р-ЯМА,В 1 е 3 -ЬСКР(1-29)"Я 1имеющего следующую формулу:Н-Н 1 в-Р-БИА-Авр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-Авп-Бег-Туг-Атр-Ьув-Ча 1-Ьец-С 1 у-С 1 п-Ьец-Бег-А 1 а-Лгр,ув-Ьец-Ьец-С 1 п-Авре-Б 1 е-Бег-Ага-Яйосуществляют последовательно с использованием пептидного синтезатора Бек" ман 990 на смоле МВНА аналогично примеру 1. По данным Т.С и НРЬС пептид является практически чистым.Результаты анализа приведены в таблице,Проведены биологические испытаниясинтетических пептидов, приготовлен" ных в примерах.Для сравнения использован искусственный человеческий фактор выделения гормона роста. В опытах 1 п чсго обнаружено, что пептиды, полученные ;в условиях предлагаемого способа обладают в общем большей мощностью для секреции гормона роста (СН) и подобных присущих им активностей. Все этиискусственные пептиды рассматриваютсякак биологически активные и потенциально полезные для стимуляции выделения гормона роста через гипофиз.При проведении испытаний применяли культуры, включающие клетки гипо" физа крысы, удаленные 3-5 дней назад.Такие культуры считаются оптимальными для секреции гормона роста и ихприменяют в сравнительном испытании,проводимом согласно способу Вейла,Инкубационный период для испытываемого вещества составил 3-4 ч. Рликвоты культивируемой среды удалили и обрабатывали для измерения их содержимого в иммунореактивном гормоне роста СН( 1 т СН) способом радиоиммунологии.Результаты сравнительного испытания для экоимомерйых концентраций показаны в таблице.Испытания 1 п ч 1 гго искусственных пептидов показывает, что многие из них обладают более высокой биологической силой, цем, например (в части мозга под зрительным бугром) ЬрСКР (1-40)-ОН: минимальная эффективная концентрация, Д-иэомер аланина 2, норлейцин человеческий ЬСВХ(1-29) аминогруппа составляет примерно 1 ммоль.Помимо испытаний 1 п ч 1 гго для секреций гормона роста искусственные пептиды вводили внутривенно крысам"самцан с анесеэиоованием уретаном. При этом ; скусственные пептды подавляют самопроизвольную секрецию гормона роста беэ уничтожения реакции на наружный фактор выделения гормона5 роста (СН). Ло инъекции спустя 10, 30 и 90 мин брали анализ крови. Уровни гормона роста (СН) в крови, измеренные пробирочной радиоиммунологией, показали, что искусственный Л-изомер аланина 2, норлейцин 1-человеческий ИСКР(1-29)-1 Л 1 примерно в б раз сильнее, чем человеческий АДСКИ 1-40)ОН в отношении уровней в крови гормона роста, выделяемого гипофизом, при измерении через 10 и 30 мин после 14-й инъекции, Для подтверждения этих результатов применяли другие известные испытания гп чегго фактора выделения гормона роста (СРХ), которые эффек 20 тивны в определении секреции гормона роста. Считают, что дозы примерно 50 нг и примерно 5 мг этих пептидов на 1 кг веса тела являются эффективными, чтобы вызвать секрецию гормона роста.Некоторые пептиды, которые обладают равной или даже слегка меньшей биологической силой в испытаниях гп чегго чем стандарт, в жизни имеют значительно большую силу.Такие искусственные аналоги человеческого ЬСГГ и крысиного СКГ, бычьего и поросячего аналогов (в црСКР) могут быть отнесены к категории мало- З 5 токсичных соединений.Таким образом, проведенные биоло" гические испытания показали, что пептиды, полученные в условиях предлагаемого способа малотоксичны и облада40 ют более высокой эффективностью в отношении стимулирования выделения гормона роста гипофизом в сравнении с синтетическим человеческим фактором выделения гормона роста пСГГ(1-40)ОН, 45 Кроме того, получаемые данным способом пептиды имеют более короткую цепь (29 аминокислотных остатков), что значительно упрощает их получение,50формула и зобретения Способ получения пептидов общейформулы 1 К-К -Аяр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-К -Бег 2 Ь-К 1 о -АгР,-К-Г 1 Ъ -К 4 -С 1 у-С 1 п-Ьец-Кя-А 1 а-Агв"Ьуя-Ьец-Ьец-Г -Г -Г. -В 1 еФ Яя 76йя 19Где К - Туг, Нгя;К - А 1 а, 1 ИИА;К - Бег Аяп;К, - Туг, Туг;К - Агр Ьуя;К - Пе, Ча 1;К, - 1 Ьец Ьец;.К,я - Туг, Бег;Кг+ - Нз.я, С 1 пК - С 1 п, Аяр;Кя - Аяп, Бег;1 Аг;У МН %СтНпри условии, что или К - МРАили К,4 - 1 Ьец или КдВАгр,о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтоВос Агд(Тоя) или Вос 1 Агд(Тоя) связывают с полимерной смолой БУБНА илиМЕРМ Вос-защитную группу отщепляюти затем строят пептидную цепь, постепенно присоединяя аминокислотныеостатки в последовательности, обусловленной Формулой 1, полученный приэтом пептидилполимер общей формулы 11Х-К(Х или Хг)-Г-Аяр(Х)-А 1 ае-РЬе-ТЬг(Х)-Гэ-(Х или Х) --Бег(ХО)-К,о (Х)-Агд(Х 6)-К 1 г (Хяили Хт) -К, -Г -С 1 у-Г 1 п(Х) -Ьец-К в (Х ) -А 1 а-Агд (Х в) -Ьу я (Хт) -Ьец-Ьец-К 4(Х или Х ) -К. (Х ) -11 ее-Г (Х+или Х ) К (6)где Х - тозил,Х = Вос;Ха 2 п ЛихлорбензилХХ 4 бензиловый эфир,Х - ксантил,Х - 2-С 1-бенэилоксикарбонил,Х- смола-носитель ГБНА или ЕА,деблокируют и отщепляют пептид отсмолы-носителя и/или с использованием фтористого водорода в сочетаниис анизолом или метил-этилсульфидомили их смесью в качестве акцепторапри температуре от 0 до -20 С, полученный продукт растворяют в уксуснойкислоте и очищают, 1530097 12О О М Я в л дО ОЧлЮ еО1 йДйр 4-3О л в л еЧ а ев л Л 1 лв вЛ 3 Д 11 33 .3 ь 13 3313 -33 3 3" 4 .Я 1 3 е 33 1 СЧ М ОСЛ СЧ ОМ Л МСЧ Л 0 Л в в вв а1 в а в е,в а в а фф сч-О -о - 01 счо л 01 ю Ю Л СЧ СЧ Л Л 1 -М -- Ю СО - М е 1 1 1 11 СЧ О й Л СЧ СЧ О О О й Мф М СЧ ф ав в а в а а в а в а в в в еееео Ме ММСЧ ЮЮСЧ МММ ЛСЧ 1 1 1ОООООООООООООООООМ Ю М СЧ СЧ СО О Л СО О Мо (Ч:3 -СЧ М л- е- и " М О 1 СЧ СГ СЧ СЧ МЪ-СО1 1 ч 41 СЧ е, 1 с 3 М 1 4 3 1 ЙС- о 3- и всг Кй , се 3;1 1 0 е 01 О е- О 001 л1 СЧ СЧ,Ю сеСЧ СЧ 1 си О С 3 3 1ЦгСЧ 1 С 33 И СЧЯ 3 Ч- е - г М Оа - л М 1 Йл 1г, в л 0 ОО С-) НО С,ле Г Й е 3 0 0 О Х СЧ СЧ 0,3: Д3,3: 3-3 Д, Г- б СЧ СЧ СЧ С.3 1 1 СЧ 1 13 Ы 1 34 МСО С 5 1 1 1 1,й 1 3 а во осчс с-) С 3 аеЛ,31,С:1,3 - сд дХ 1 1 5 С 5 .Э С Н 1 л О Ис 4 Х Вее М И 3 а 1 1 Н в ХРВ -л аОа 1а Й Е,Л ее г-е - з - 3 е 3- С 3 3 - 3 сее 1 Е , де в 1 С 3 фЧ 3 Н 3 веЕ а ф е 3 3 1 С 3 СЧ С 4 еЕ В МС 4;М 4 Е е еЕ Й М 4 С 3 1 В В В В -В Н В й-1 Н В В В Рлеел 1 - 1 н Йа Вле-ел 1 кккк "-1 кака к -икки