Способ получения пептидов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСН ИХ ЯО,4 БЛИН гктени АТЕНТУ 750475/23-04СТ/НБ 83/015641.06.84326634,10.82.83) неи тнои поей указаненной пепХ,ТУг (Х) -9,88. Бюл. Хф 35 Салк Институт ф з (ЦБ)Эдуард Фредерик ис (01) и Вили У олоджиРивье (СН),лкер.Вейл о олее чены син ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ОПИСАНИЕ И(56) Химия полипептидов, / Под ред,П.Катсояниса. - М.: Мир, 1977, с,368,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ(57) Изобретение касается производства синтетических пептидов, в частности получения соединений общей формулы Н.Туг-А 1 а-Аяр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-Аяп-Бег-Туг-Аг 8-1,уя-Ча 1-1,ец-ЭА 1 а-С 1 п-Ьец-Бег-А 1 а-Агц,уя.ец-Ьец-С 1 п-Аяре-Мег-Бег-Агц-С 1 п-С 1 п-С 1 У-Я, гдеГ = НН или С 1 ц-Бег-Аяп-С 1 п-С 1 ц-Агя-С 1 у МЙ , которые могут быть использованы в медицине. Цель. - созданиеновых укороченных пептидов с низкойтоксичностью, способных стимулировать выделение гормона роста. Их синтез ведут реакцией трет-бутилоксикарбонил-С 1 у с и-метилбензгидриламин 511С 07 К 7/10 /, А 61 К 37/02 гидрохлоридной смолой с последующим удалением защитной группы и дальшим наращиванием пептидной цепи в соответствии с аминокислоследовательностью, отвечающной формуле. Затем от получтидной смолы общей формуль 1-С 1 п(Х )-С 1 ц(Х )-Агд(Х ) - С 1 у Х,Х - трет-бутилоксикарбонил, Х -2,6-дихлорбензил; Х з - бензиловыйэФиР; Х 4 - бензил Х 5 - ксантил;толуолсульфонил; Х, - дихлорбензилоксикарбонил; Х 9 - остаток п-метилбензгидриламиногидрохлоридной смолы,отщепляют трет-бутилоксикарбонильнуюгруппу обработкой СНСООН в средехлористого метилена. Далее проводятдеблокирование и отщепление полимерной смолы с помощью обработки продукта НР в присутствии амизола, Н выепептиды по активности близки к человеческому гормональному выделительному фактору (1-44)ИН, но б доступны, т.к. могут быть полутетическим путем. 1 табл.После снятия защиты и нейтрализа ции пептидную цепь выстраивают ступенька за ступенькой на смоле. Снятие защиты, нейтрализацию и добавление каждой аминокислоты осуществляют в соответствии со способом по схемам 45 АиВ.Снятие защиты предпочтительно осуществлять согласно схеме А. Реагент Время смешивания, ыин 50 607 трифторуксуснойкислоты / 27 этандитиола607. трифторуксуснойкислоты / 2 этанди 10 55 тиолаИзопентанол / 17, этан 0,5 дитиола Изобретение относится к способу получения пептидов - новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.Цель изобретения - способ получения новых синтетических укороченных пептидов, малотоксичных соединений, обладающих способностью стимулировать выделение гормона роста. ОП р и м е р 1, Синтез пептида (О-Ала ) - человеческий панкреатический гормональный выделительный фактор (1-39)-НН, имеющего формулуН в Т-А 1 а-Лзр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-Азп -Бег-Туг-Агя,уз-Ча 1 - 1,еи-ПА 1 а-С 1 п-Бег-А 1 а-Агц.уз,еи-Ееи,еи-С 1 п-Азре-Мег-Бег-Агц-С 1 п-С 1 п-С 1 у-С 1 п-Бег-Азп-С 1 п-С 1 п-АгВ-С 1 у-ННосуществляют ступенчатым образом, ис пользуя пептидный синтезатор Бекман 990, на параметилбензгидриламингидрохлоридной смоле, такой, какую поставляет фирма ВасЬеш. 1 пс.,имеющей пределы замещения примерно 0,1 - 25 0,5 млмоль/г смолы. Связывание трет-бутилоксикарбонил-С 1 у с 2 г смолы осуществляют общим способом, в схемах А и В, которые используют во всем синтезе, и это дает замещение 30 примерно 0,35 млмоль С 1 у на грамм смолы, Все используемые растворители тщательно обезгаживают путем продувки инертным газом, например гелием или азотом, чтобы гарантировать отсутствие кислорода, который может нежелательно окислить серу остатка Мег.Тризтиламин (107.) вСН С 1МеОНТриэтиламин (107) вСН,С 1 гМеОН (дважды)СНС 1 (дважды)Связывание предпочтительноствлять согласно схеме В: 0,5 0,5 0,50,50,5осущеВремя смешивания мин Реагент/И,Н -ДициклогексилкарбодиимидТрет-бутилоксикарбонил-аминокислота МеОН (дважды)СНС 1 (дважды) СаО (3 моль/л) в СН,С 12СН,С 1,МеОНСНС 1(дважды) 50-90 0,5 0,5 15,0 0,5 0,5 0,5 От одного до двух млмолей аминокислоты, защищенной трет-бутилоксикарбонидом, в хлористом метилене используют на грамм смолы в сочетании с одним эквивалентом 1,0 молярного И,М -дициклогексилкарбодиимида в хлористом метилене в течение двух часов. При связывании трет-бутилоксикарбонил-Агц (толуолсульфонил) используют смесь 507. диметилформамида и хлористого метиленаБензиловый эфир используют в качестве гидроксильной защитной группы боковой цепи для Бег и ТЬг. Паранитрофениловый сложный эфир используют для активации карбоксильного конца Азп или Г 1 п, и, например, трет-бутилоксикарбонил-Азп (пара-нитрофениловый эфир) связывают в течение ночи, используя один эквивалент бутилового спирта в 507.-ной смеси диметилформамида и хлористого метилена, причем в этом случае добавляют дициклогексилкарбонид. Аминогруппу Азп или С 1 п защищают ксантилом, если вместо способа активного эфира используют дициклогексилкарбонильное связывание. Дихлорбензилоксикарбонил используют в качестве защитной группы для боковой цепи 1,уз. Толуолсульфонил используют для защиты гуандиновой группы Агд, а карбоксильную группу С 1 у или Азр защищают бензилом. Фенольную гидроксцльную группу Тяг защищают 2,6-дихлорбензилом. В конце синтеза получают пептид-С 1 у(Х,),где Х, - трет-бутилоксикарбонил, Х -2,6-дихлорбензил, Х - бензиловыйэфир, Х- бенэил, Х- ксантил, Х -толуолсульфонил, Х, - дихлорбензилоксикарбонил, Х - ЬН-смоляной носитель. Ксантил может быть частичноили полностью удален обработкой трифторуксусной кислотой, используемойдля удаления 1-аминозащитной группы.После связывания со смолой последнего остатка Туг, трет-бутилоксикарбонил удаляют 6 ОЕ-ной трифторуксусной кислотой в СНС 1и получают3,4 г защищенной пептидной смолы. Дляотщипления защитных групп. с остального защищенного пептида-смолы, егообрабатывают 1,5 мл анизола, 0,5 млметилэтилсульфида и 15 мл фтористоговодорода на грамм пептида-смолы при- 20 С в течение получаса и при 0 Св течение получаса. После удаления/фтористого водорода под высоким вакуумом остаток смолы-пептида промываютпопеременно сухим диэтиловым эфироми хлороформом, а затем пептид экстрагируют обезгаженным 2 н.воднымраствором уксусной кислоты и отделяют от смолы фильтрованием.Отщепленный и лишенный защитыпептид затем растворяют в 0,57-нойуксусной кислоте и подвергают егоочистке, которая может включать тонкую гель-фильтрацию на СефадексеС. Получают около 1,62 г пептида,Затем пептид подвергают дальнейшей очистке с помощью препаративнойили полупрепаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией. Кассетную установку Юаег Аззос 1 агезргер. Ь. Сзаполняют на 17 микронС кремнезом, поставляемым фирмойЧцс 1 аз 300 А. Градиент ОНСИ в ТЕАРсоздают с помощью градиентного маркера низкого давления Е 1 с 1 ех, Хроматографические фракции тщательно отбирают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и собираюттолько фракции, обладающие значительной чистотой, Обессоливание очищенных6455 1020 25 303540 4550 фракций, независимо проверенных на чистоту, осуществляют с помощью градиента СНОСЕ в О, 17-ной трифторуксусной кислоте. Центральный срез затем лиофилизируют, получают 107 млг целевого пептида, чистота которого около 1002. Величина оптического вращения чистого пептида Р 1 0 = -56,3П р и м е р 2. Синтез пептида П-Лла " 3- человеческий панкреатический гормональный вьщелительный фактор (1-32)-ИН, имеющего формулуН-Туг-Л 1 а-Аяр-А 1 ае-РЬе-ТЛг-Азп-Бег-.,Туг-Аг-Ьуз-Ча 1-Ьец-Э-А 1 а-С 1 п-Ьец-Бег-А 1 а-Агв-Ьуз-Ьец-Ьец-Ьец-С 1 п-Ляре-Мег в Б-Агр-С 1 п-б 1 у-ИН,осуществляют ступенчатым образом, используя пептидный синтезатор Бек" ман 990, на параметилбенэгидриламиновой смоле по примеру 1. Получают ,96,5 Е пептида 96,57-ной чистоты при использовании тонкостенной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Величина оптического вращения составляет Ы 0 = = -57,9П р и м е р 3. Синтез фрагмента человеческого панкреатического гормонального вьделительного фактора, т.е. человеческого панкреатического гормонального выделительного фактора (1- 32)-ИН, формулыН-Туг-А 1 а - Ая р-А 1 ае-РЬ е-ТЬ г-Азп-Бег-Туг-Агв-Ьуз-Ча 1-Ьец-С 1 у-С 1 п-Ьец-Бег-А 1 а-Агя-Ьуз-Ьец-Ьец-С 1 п-Ляре-Мег-Бег-Ага-С 1 п-С 1 п-С 1 у-МН,осуществляют ступенчатым образом, используя пептидный синтезатор Бекман 990, на параметилбензгидриламиновой смоле по примеру 1. Этот аналог признан по существу чистым при использовании тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.П р и м е р 4. Синтез фрагмента человеческого панкреатического гормонального вьделительного фактора, т,е. человеческого панкреатического гормонального выделительного фактора (1- 39)-ИН, имеющего формулуН-Туг-А 1 а-Азр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-Азп-Бег-Туг-Агя-Ьуз-Ча 1-Ьец-С 1 у-Ип-Ьец-Бег-А 1 а-Агд-Ьуз-Ьец-Ьец-С 1 ц-Азре-Мег-Бег-Агц-С 1 ц-С 1 ц-С 1 у-С 1 ц-Бег-Азп-С 1 п-Иу-Ага-С 1 у-ИН 255 6При проведении испытаний используют клетки типа РАР/СКГ, Культурная среда: 2 Х ГСБ + 5 п 11 РЕХ(р -Р 1) + Среда инкубирования: 0,17 бис-(триметилсилил)-ацетамидаскорбиновая кислота/НП 1 е;(термин ГСБ означает эмбриональную телячью сыворотку, 0 ЕХ - дексаметазон, термин РАР означает крысиную переднюю долю гипофиза и показывает, что при испытании использовали первичные кулвтуры клеток передней доли гипофиза крысы).Испытания 1 п чегго этих синтетических пептидов показывают, что эффективная концентрация, дающая 507- ный эффект (ЕС,), изменяется от 20 до 00-пикомолярной, а самая низкая эФфективная концентрация составляет 3-8 пмоль в литре. Максимальная эффективная концентрация для человеческого панкреатического гормонального вьделительного фактора была примерно 1-наномолярной.Кроме испытании хп чегго на секрецию гормона роста, проводили также эксперименты хп чиччо путем введения синтетического пептида через вживленный катетер в свободно бегающих нормальных самцов крыс. Животных предварительно обрабатывают ГЬ А, ингибитором допаминовой гидроксилазы, который подавляет спонтанную секрецию гормона роста, не влияя на реакцию к экзогенному гормональному вьделительному фактору, Образцы крови беН-Туг-А 1 а-Азр-А 1 а-А 1 е-РЬе-ТЬг-Азп-Бег-Туг-Агц-Ьуз-Ча 1-Ьец-А 1 а-С 1 п-Ьец-Бег-А 1 а-Агя-Ьуз-Ьец-Ьец-С 1 п-, -Бере-Ме-Бег-Агд-С 1 п-С 1 п-С 1 у-С 1 ц-Бег-Азп-С 1 п-С 1 у-Агц-С 1 у-ИН, осуществляют ступенчатым образом, используя пептидный синтезатор Бек)ман 990, на параметилбензгидриламиновой смоле по примеру 1. Пептид признан по существу чистым при использовании тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Проведены биологические испытания полученных соединений.Для определения эффективности различных синтетических пептидов при стимуляции выделения гормона Ьоста проводят анализы 1 п 1 сго, используя в качестве стандарта синтетический человеческий панкреатический гормональный вьделительный фактор (ЬрСКГ(1-40)ОН, поскольку он являет ся эквивалентом нативного пептида) при параллельном сравнении с эквимолярными концентрациями природного ЬрСКГ(1-44)МН - и различных других синтезированных аналогов40Используют культуры, которые включают клетки гипофиза крысы, удаленного за четыре или пять дней до этого, Культуры, которые считаются оптимальными для вьделения гормона рос та, используют для сравнительного испытания. Инкубирование испытываемого вещества осуществляют в течение 3-4 ч, после чего берут аликвоты культуральной среды и обрабатывают, чтобы из мерить содержание в них иммунореакционного гормона роста хорошо известным способом, радиоиммуноанализа.Результаты сравнительных испытаний в виде протокола приведены в 55 таблице.В таблице дан уровень гормона роста в образцах клеточных культур методом радиоиммунного анализа. рут через этот же катетер непосредственно перед инъекцией и через 5 и20 мин после нее, уровни гормона роста в крови измеряют с помощью радиоиммуноаналиэа. Результаты показывают,что синтетические пептиды, полученные предлагаемым способом, являютсямощными стимуляторами секреции питуитарного гормона роста и сравнимы поактивности с природными гормональными вьделительными факторами. Таким образом, проведенные испытания показали, что соединения, полученные предлагаемым способом, являются малотоксичными биологически активными соединениями, способствующими секреции гормона роста, по активности они близки человеческому гормональному вьделительному фактору (1-44)КН, но доступнее его, поскольку содержат в своей цепи меньшее число аминокислотных остатков (32 и 39) 5 14264 осуществляют ступенчатым образом, используя пептидный синтезатор Бекман 990, на параметилбензгидриламиновой смоле по примеру 1. Пептид приз 5 нан по существу чистым при использовании тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.П р и м е р 5. Синтез пептида 0-Ала3 в человеческий панкреатический гормональный вьделительный фактор (1-39)-МН, имеющего формулу426455 и могут быть получены синтетическимпутем. Формула изобретения Способ получения пептидов общейформулы 1 Н-Туг-Л 1 а-Азр-Л 1 ае-РЬе-ТЬг-Азп-Бег-Туг-Агк-Еу з-Ча 1-1.ец-ПА 1 а - С 1 п- -1,ец-Бег-А 1 а-Аге.уз.ец,ец-С 1 п-Азре-Мег-Бег-Лг 8-С 1 п-С 1 п-С 1 у,где 0 - ННили С 1 ц-Бег-Азп-С 1 п-С 1 ц-Агд-С 1 у-НН 1 о т л и ч а ю щ и й с я тем, что трет-бутилоксикарбонил-С 1 у вводят во взаимодействие с параметилбенэгидриламингидрохлоридной смолой, уда-; ляют защитную группу и затем проводят постепенное наращивание пептидной цепив соответствии с аминокислотной последовательностью, отвечающей соединению общей формулы 1, и от.полученной пептидной смолы общей формулы 11 1 О 20 25 Среднее Конц/дозазначение Пептид Показания счетчика 0,81 1,17 1,3 1,09 Контроль 2,02 1,55 1,90 2,15 1 ОЛ 0,4 пИ 0,004 ЬрСНР( - 40)ОН 3,57 50 Л 3,54 3,58 3,65 0,02 102-34-5 7,60 7,74 6,34 7,22 10 Л 10 пМьо О,1 11,99 8,87 10,00-Азп(Х) -С 1 п(Х)-С 1 ц (Х -Агд(Х)-С 1 у Хэ,Х, - трет- бутилоксилкарбонил;Х,6-дихлорбензил;Х- бензиновый эфир,Х - бенэил,Х - кс антил,Х-толуолсульфонил,Х, - дихлорбензилоксикарбонил;Х- остаток параметилбенэгидриламингидрохлоридной смолы;отщепляют трет-бутилоксикарбонильнуюгруппу обработкой трифторуксуснойкислотой в хлористом метилене и затем проводят деблокирование и отщепление полимерной смолы обработкой полученного продукта фтористым водородом в присутствии анизола,,0 1426455 Продолжение таблицыОбразцы клеточных культур Среднее Конц/доза Пептид значение 125 Показания счетчика( 02 Об 7 02268) 5 Л 200 пИ 1 12,23 13,2113,61 12,86 501 10 13,55 Составитель В.ВолковаРедактор В.Бугренкова Техред И,Дидык Корректор И.Муски Тираж 348 Подписное Заказ 5846 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул, Проектная, 4 4,37 5,28 13,84 14, 18 12,50,4 ПИ 02004О,О 2 О,5 250 пИ 225 12,5