Способ получения пептидов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 511 4 С 07 К 7/1 К 37 02 ГОСУДАРСТВЕННЫПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГННТ СССР ОМИТЕТОТНРЫТИЯМ БРЕТЕН ЕНТУ ОПИСАН И(71) Дзе Салк Институт фор Биолоджикал стадиз (1 Я)(72) Жан Эдуард Фредерик Ривьер (СН) Вили Васкер Вэйл - младший (цЯ) и Иохим Шписс (ЭЕ)(56) Шредер Э., Любке К., Пептиды. Ч, 1, М. Мир, 1967, с. 116, 398. Г 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ 1,57) Изобретение касается пептидов, в ч астности соединений общей ф-лы Н - К -А 1 а-Аяр - А 1 ае-РЬе-ТЬг-К -Яег 1-К, -Ат 8-К, -К, -1.ец-К-.С 1 п.ец-Ке - -А 1 а-Агдуя - 1.ец.ец-К -К, Пе-К - -МУ, где Я = а) - Авп-Ага, б) - Аяп-, -Ат 8-С 1 п-С 1 п-С 1 ц-,в) -Аяп-Агд-С 1 п-С 1 п-С 1 у-С 1 ц-Атд-Аяп 1 п-С 1 ц-С 1 п-Аг 8-Яег-Аг 8-РЬе-Аяп-Ча 1, г) Аяп-Агц-С 1 п-С 1 ц-С 1 у-С 1 цАг-Аяп-С 1 п 1 ц-С 1 п-Агр-Яег-АГК РЬе-Авп-, У = ОН, БН, К = Туг, О-Туг, Нв, К = Яег, Ко= Туг,Э-Туг,К=АгК Ко = 11 е К 1 = С 1 У; Кч = Тут В-Мет, Ме, Ча 1, которые обладают способностью вызывать секрецию природнО- го гормона роста, что может быть использовано в медицине. Цель - созда 80147724 ние новых малотоксичных и активныхпептидов. Их синтез ведут связыванием С-конечной аминокислоты с полимером-носителем МБГА или хлорметилированной смолой с последующим отщеплением аминозащитной группы и постепенным наращиванием пептидной цепи в соответствии с последовательностью,указанной в ф-ле, до образования пептидил-полимера общей формулы Х,К,(Х)-Яег(Х) -Агд (Хс) -РЬе-Авпа 1 г) - Аяп-Агд(Хб) -С 1 п(Х ) -С 1 п(Х) -С 1 у 1 ц(Х)-Агд(Х ) -Аяп-С 1 п(Х) -С 1 ц(Х )-С 1 п(Х,) -Агд(Хв) -Яег(Х) -Агя(Х) -РЬе-Аяп-. Далее полученный пептидил полимер деблокируют и отщепляют полимер-носитель. Новые вещества оказывают влияние на секрецию гипофизныхжелез, что можно использовать в сельском хозяйстве и для диагностических целей, 2 табл.Деблокирование и редпочтительно проводят в соответствии в соответствии со схемой А:Реагент Время. 45смещивания,мин 1.607. ТРА/27тандитиол2.607, ТРА/27.этандитиол 13.1 РА/ 7 этацдитиол4.Е,1(107) я СН,С 1,5.МеОН6.ЕГ 11(107.) в СН С 17 .МейН (дважды)8, СН, С 1 (дважды)Связывание и редичтит ельнопо схеме В: 1 О 50 50,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 првопят 55 Изобретение онси гс я кпспбуполучения пептидов - нсвьтх биолгически активнык сспиваний, которыемогут найти и 1 пмепс н ие в медицине и5ветеринарии.Цель изобретения - получение химическим путем новых пептидов, способствующих выдслепию гормона ростагипофизом, - более. активных и мало- Отоксичных соединений,П р и м е р 1, Синтез гЬ СКЕ (1-43)имеющего формулу Н-Ндв-А 1 а-Аяр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-Бег-Бег-Туг-Агя,-Агде - Ьец-С 1 у-С 1 ц - Ьец-Туг в А-Агд(Хап) со смолой осуществляют по общейаметодике, используя КР в ДМФА и ри 60 С 25в течение 24 ч при переменивании.Это ведет к замещению 0,35 ммольАяп на 1 г смолы.После деблокировки и нейтрализации пептидную цепь ступенчато наращивают на смоле. Деблокирование,нейтрализацию и добавление каждойаминокислоты осуществляют в общемсоответствии с методикой. Все используемые растворители тщательнодегазируют пробулькиванием инертного газа, например гелия или азота,чтобы обеспечить отсутствие кислорода, который мог бы нежелательным.образом окислить серу остатка Мес.; 40 Время смеРеагентшивания, мин 9,ПСС 1,1 О. Вос-аминокислоты 50-901 .МеОН (дважды) 0,5 12.СН Г 1, (дважды) 0,5 13.АС О (ЗН) в СН С 1, 15,0 4.СН,С 1, 0,5 15.МеОН 0,5 16.СНГ 1 (дважды) 0,5 1 -2 ммоль ВОС-защищенной аминокислоты в метиленхлориде используют на 1 г смолы плюс один эквивалент 1,0-молярного ЭСС 1 в метиленхлориде в течение 2 ч . При связывании ВОС - -Агд(ТОБ) исполь зуют смесь 507 ДМФА в метиленхлориде, Вг 1-эфир используют в качестве защитной группы для гидроксильной боковой цепочки в случае Бег и ТЬг. Амидогруппу остатка Азп или С 1 п защищают с помощью Хап при использовании ДСС-связывания в предпочтительном варианте, п-Нитрофениловый эфир (ОМр) также может использоваться для активации карбоксильного конца остатка Авп или С 1 п, например, ВОС-Азп(ОМр) может подвергаться связыванию в течение ночи сисполь зованием одного эквивалентаНОВг в 507 смеси ДМФА и метиленхлорида, в этом случае ЭСС не добавляют.2-Хлорбензилоксикарбонил (2 С 1-г) используют в качестве защитной группыдля боковой цепочки Ьув., Тов, а также для защиты гуанидиновой группыостатка Агц, а имидозольный азот остатка Н 1 з, С 1 ц или Авр-карбоксильнуюгруппу защищают в виде Вг 1-эфира(ОВг 1). Фенильную гидроксильную группу остатка Туг защищают 2,6-дихлорбензолом РСВ. В конце синтеза получают следующий состав: Х -Н 1 в(Х) -Х - подложка на основе Сосмолы,Хап может быггь частично или полно стью удален обработкой с помощьюТРА, используемой для деблокирования Ы -аминозащитной группы.После связывания со смолой конеч -ного остатка Н 1 я ВОС удаляют с помощью б 07 ТРА в СН С 1 . Для отщепления и удаления зашить: с оставшегосязащищенного пептида-смолы, его обрабатывают 1,5 мл анизола, 0,5 млметилзтилсульфида и 1 5 мл фтористого водорода (НР) на 1 г пептидаосмолы при -20 С в течение получасаи при 0 С в течение получаса. Послеудаления НР в условиях вакуума оставшийся пептид-смолу промывают поочереди сухим диэтиловым эфиром ихлороформом, а затем пептид экстрагируют дегазированной 2 н. воднойуксусной кислотой и отделяют от смолы фильтрованием,-С 1 п (Х ) -С 1 у-С 1 ц (Х ) - Агд (Х 6 ) -Расщепленный и лишенный защиты пептид растворяют в 0 в 57 в уксус - ной кислоте и подвергают очистке, которая может включать тонкую гель- фильтрацию на Сефадексе С.Затем пептид очищают препаративной или полупрепаративный высокопроизводительной жидкостной хроматографией. Гильзы для ЬС в 5 фирмы Юагегя Аяяосдагея заполняют С, кремнеземом 1 5-20 мкм, поставляемым фирмой Чужая (300 А), Градиент ацетонитрила (СНСЕЕ) в ТЕАР создают с помощью аппарата для получения градиента низкого давления фирмы Е 1 йех . Хроматографические фракции тщательно контролируют с помощью высокоэффективной . жидкостной хроматографии и объединяют только фракции, проявляющие достаточную чистоту. Обессоливание очищенных фракций, независимо проверенных на чистоту, осуществляют, используя гради-, ент СНСИ в 0,17.-ной трифторуксусной кислоте. Затем диофилизируют центральный срез, чтобы получить нужный пептид, чистота которого составляет выше 987 С помощью тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии определяют, что пептид свободной кислоты являетсяпо существу чистым, Для всех очистокс помощью высокоэффективной жицкостной хроматографии используют 5-микронную аналитическую колонку ЧуЙас Сщ . Пептид удаляют из колонки,используя смесь буфера А (0,17-наяводная трифторуксусная кислота) ибуфера В (607. ацетонитрил в 0,17-нойводной трифторуксусной кислоте).При5.1 об.7 буфера В пептид элюируетсяпри 8,9 млОптическое вращение измеряют на фотоэлектрическом поляриметре. Оно составляет ес= -52,4 ++1 (С = 1, 17-наяуксусная кислота,не скорректировано) .Синтез повторяют, используя смолуМВНА, чтобы получить гЬ СКР (1 -43)- -ИН, применяя методику, обычно используемую в данной области для связывания Аяп к смоле МВНА. Определяют,что пептид является по существу чистым с помощью тонкослойной хромато графии и высокоэффективность жидкостной хроматографии, Оптическое вращение измеряют на фотоэлектрическом1 тполяриметре. Оно составляет Гы."Е,-А 1 а-Агд - Ьу я-Ьец -Ьец -Ня-С 1 ц -11 е-И 1 е-Аяп-Аге-С 1 п-С 1 п - С 1 у - 1 ЕН проводят ступенчатым образом, используяпептидный синтезатор "Бекман"на смоле МВНА (как в примере 1) . Оп - 40 ределяют, что этот аналог являетсяпо существу чистым с помощью тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии приэлюирован;:и из колонки высокоэффек тивного жидкостного хроматографа при8,4 мл с 557.-ным буфером В, Оптичеоское вращение составляет -55,8 +1(С = 1, 1 7-ная уксусная кислота) .П р и м е р 3, Синтез Б-Туг"-гЕт СКР (1 -29) -ИН, имеющего формулуН-Туг-А 1 а-Аяп-А 1 ае-РЬе-ТЬг-Яег-Яег-Р-Туг-Агя - Агде-Ьец-С 1 у-С 1 п - Ьец-Туг-А 1 а-Ага-Ьуя-Ьец - Ьец-Ня-С 1 ц -11 е-Ие г -Аяп-Агд-ИН2 755проводят ступенчатым образом, исполь - зуя пептидный синтезатор "Бекман" нд смоле МВНА (как в примере 1) . Определяют, что с помощью тонкослой 14772ной хроматографии и выгокопропзнодптельной жидкостной хроматот рафии при элюировании из колонки высокоэффек - тивного жипкостного хроматогрфа при5 9,0 мл с 617-ным буфером В показывают, что пептид практически чистый. Оптичео ское вращение составляет -63,6 + (С = 1, 17.-ная уксусная кислота) .П р им е р 4.Синтез Ь 1 уг-гЬСКР 1 О (1-29-МН, имеющего формулу Н-Туг-А 1 а-Авр-А 1 ае-РЬе-ТЬе-Яег-Яег-Туг-Ага-Агце-Ьец-С 1 у.С;1 у-Ьец-Туг-А 1 а-Агд- -1,ув-Ьец-Ьец-С 1 п - С 1 це-Мег-Авп-Ата-МН, провоДят ступенчатым образом,ис пользуя пептидный синтезатор "Бекман" (как в примере 1) .Определяют, что пептид является по существу чистым с помощью тонкослойной хроматографии и высокопроизводительной жидкостной20 хроматографии при элюировании из колонки высокопроизводительного жидкостного хроматографа при 7,8 мл с 58% - ным буфером В, Оптическое вращение составляет -49,6 +1 (С = 1, 25 17.-ная уксусная кислота) .П р и м е р 5. Синтез гЬ (1 -43) -ОН формулы Н-Н 1 в-А 1 а-Авр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-Яег-Яег в Туг в - Агде-Ьец-С 1 у-С 1 п-Ьец в Т-А 1 а-Ага в Ь-Ьец-. 30 - Ьец-Н 1 в-С 1 це-Мег-Авп-Агд-С 1 пС 1 п-С 1 у-С 1 ц-Ага-Авп-С 1 ц-С 1 ц-С 1 п-Ага-Яег-Ага-РЬе-Авп-ОН проводят ступенчатым методом с использованием пептидного синтезатора "Бекман" на35 хлорметилированной смоле, имеющей интервал замещения 0,1 -0,5 ммол/г смолы, по методике, описанной в примере 1.При использовании ТСХ и ЖХВД пеп тид признан существенно чистым. Оптическое вращение измеряют на фотоэлектрическом поляриметре, Оно составляет о =- -50,8+1 (С = 1,17.-ная уксусная кислота, не скоррек тировано)Синтез повторяют с,использованием смолы МБГА для получения гЬ СКР (1 -43) - МН. При этом в качестве исходной аминокислоты используют Авп. При использовании ТСХ и ЖХВД пептид признан существенно чистым. Оптическое вращение измеряли на фотоэлектрическом поляриметре, оно составляет Я= -51,7 + 1 (С = 1, 1%-ная уксусная кислота, .: скорректировано),П р и м е р 6. Синтез Ьр СКГ аналога, з,е. М 1 е 1 - гЬСКР (1 - 32) - -МН , имеющего Формулу Н-Н 1 в-А 1 а-Авр 48 6-А 1 ае-Рйе-ТЬг-Яег-Яег-Туг-Агц-Агд-И.е,еи - 01 у-С 1 п.ец-Туг-А 1 а-Агц-Ьув,ец -1.ец-Н в-С 1 це-М 1 е-Лвп-Ага-С 1 п-С 1 п-С 1 у-МН, проводят ступенчатым методом с использованием пептидного синтезатора "Бекман" на МБГА-смоле, как в примере 1. При использовании ТСХ и ЖХВД аналог признан существенно ч ис тым .П р и м е р 7. Синтез фрагмента аналога Ьр СКР, т,е.Р-Туг-гЬ СКР (1-29) -МН . имеющего формулу Н-Ндв-А 1 а-Авр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-Яег-Яег-П-Туг-Агд-Агце-Ьец-С 1 у 1 п- -1.ец-Туг-А 1 а-Аг-Ьув-Ьец-Ьец-Нв - -С 1 це-ИеГ-Авп-Агд-МН, проводят ступенчатым методом с использованием пептидного синтезатора "Бекман" на МБГА-смоле (как в примере 1) .При использовании ТСХ и ЖХВД паптид признан существенно чистым.Синтез повторяют с замещением 0-Туг вместо Ндв на М-конце с получением 0-Тут " 3 -гЬ СКР ( -29) -МН.П р и м е р 8. Синтез ЬМ 1 е" -гЬ СКР ( -32) -МН, имеющего формулу Н-Ндв-А 1 а-Авр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-Яег--Яег-Туг-Ага-Агае-Ьец-С 1 у-С 1 п,ец-Туг-А 1 а-Аг 8-Ьув-Ьец-Ьец-Ндв-С 1 це-М 1 е-Авп-Агя-С 1 п-С 1 п-С 1 у-МНз проводят ступенчато с использованием пептидного синтезатора "Бекман" на МБГА-смоле (как в примере 1)При использовании ТСХ и ЖХВД пептид признан существенно чистым. Оптическое вращение измерялось на фотоэлектрическом поляриметре. Оно составляет о. = -52,6 +1 (С = 1, 17-ная уксусная кислота, не скорректировано)П р и м е р .9. Синтез гЬ СКР-Ча 1 -МН 1, имеющего формулу Н-Нтв-А 1 а-Авр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-Яет-Яег-Туг-Ате-Ьец-С 1 у-С 1 п-Ьец - -Туг-А 1 а-Агд-Ьув-Ьец-Ьец-Н 1 в-С 1 ц-Пе.+1 ет-Авп-Атя-С 1 п-С 1 п-С 1 уС 1 ц в Аг -Авп-С 1 п-С 1 ц-С 1 п-Ага-Яег-Агя-РЬеАвп-Ча 1-МН , проводят ступенчатым методом с использованием пептидного синтезатора "Бекман" на МБГА- смоле (как в примере 1) . При использовании ТСХ и ЖХВД пептид,признан существенно чистым. Вращение плоскости поляризации света составляето-50,8 (С = 1, 17-ная уксусная кис-, лота), разделения с использованием жидкостной хроматог рафии высокого разрешения проведено при аналогич -ных условиях, изложенных ранее, и с использованием .5 б 7-ного буфера В, объем удержания 7,2 мл.Проведены биологические испытания.5Полученные в различных примерах сравнивают с очищенным синтетическим Ьр СКР (1-40) -ОН или очищенным синтетическим Ьр СКР (1-40) РЬе-С 1 п-ИН в ходе анализов 1 п чегго для определения их эффективности стимулирования вьделения гормона роста (ГР).При непос.редственном сравнении используют эквимолярные концентрации различных синтезированных аналогов. Используют культуры, которые включают клетки гипофиза крыс, удаленных предварительно на 4 - 5 сут, Куль - туры, которые считаются оптимальными для вьделения гормонов роста, ис пользуют для сопоставительного испытания, Инкубирование с подлежащим испытанию веществом проводят в течение 3-4 ч, и аликвотные количества культуральной среды удаляют и обра - 25 батыиают для измерения их состава по иммунореактивному ГР (ир-ГР) с помопью оадиоиммуноанализа хорошего разрешения.Результаты сопоставительных испы - 30 таний с использованием эквимолярных концентраций приведены в табл. 1 .Испытание этих синтетических пеп - титов п ч 1 Сго показывает, что ЕС колеблется в диапазоне 20-1 00 пмоль, а низшая действующаяконцентрация составляет 3-8 пмоль. Максимальная действующая концентрация для рЬ СВР (1-40) НН составляет 1 нмоль.Результаты сопоставительного ис 40 пытания для эквимолярных концентраций различных Ьр СВР-аналогов, основанных на гЬ СКР, поиведены в табл.2.В дополнение к испытаниям дп чегго секреции гормона роста проводят так же эксперименты 1 п чиччо: вводят синте. тический пептид через постоянный катетер свободно движущимся нормальным крысам-самцам. Животных предварительно обрабатывают с помощью РЬА-б 3, ингибитором допамин-гидрокси 50 лазы, который подавляет самопроизвольную секрецию гормона роста, не влияя на реакцию на экзогенный СВР . Пробы крови отбирают через тот же55 катетер непосредственно перед инъек - пиями и спустя 5 и 20 мин после них, методом радиоиммунного анализа измеряют уровни содержания гормона ро ста в крови, Результаты показывают, что синтетические Ьр СКР-аналоги являютс я мощными стимул ято рами секреции гормона роста гипофиза. Дозировка 20 - 25 мкг на кг массы тела сочтена эффективной. Соединения относятся к категории малотоксичных. Формула изобретения Способ получения пептидов общейформулы Н-К -А 1 а-Ляр-А 1 ае-РЬе-ТЬг-К -Бег в-Авп-Агц-С 1 п-С 1 п 1 у-С 1 ц-Агд-Аяп - С 1 п-С 1 ц 1 п-Атд-Бег-Атд-РЬе-Аяп-,уК, = Тут, Р-Туг, Нгя,К = Бег,К, = Туг, П-Тут,К, = Агв,К, = 11 е;В= С 1 у;К, = Туг;К - Нгя,В = С 1 ц;К = И 1 е, 11 е, Р-Мет, Мет, Ча 1,о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтосоответствующую С-конечную аминокислоту связывают с полимером - носителем МБГА или хлорметилированнойсмолой, аминозашитнчю группу отщепляют и проводят постепенное наращивание пептидной пепи в соответствии с целевым пептидом до образования пептидил-полимера общей формулы Вос;дихлорбензил,0 В,1;В 1;ксантил; где ХХ,Х 1ХХ тозил; Х, -К, (Х 2) - А 1 а-Аяр (Х ) -11 е-РЬе-ТЬг (Хд)- -К,Х,) -Бег(Х 4) -К (Х) -Агд(Х )- -К, (Х 6)-В, -Ьец-К, -С 1 п(Х) -ЬепК в (Хт) А 1 а-Агр (Х) -Ьув(Х,) -Ьец ец Кт 4 (Х 5) К (Х ) 11 е Ка 7 1(Хв)-Авп-Агд(Х)-С 1 п(Х )-С 1 п(Х) - -С 1 у-С 1 ц (Х ) -Аге (Х ) -Авп-С 1 п(Х )-С 1 ц(Х.,) -С 1 п(Х) - -Ага (Х ) -Бег (Х ) -Агд (Хв ) - -РЬе-Аяпи полученный пептид-полимер деблокируют и отщепляют полимер-носитель. 1477248 Таблица 1 Относительная активность предлагаемых соединений Относительнаяактивность Пептид 1 М 1 е 3 -гЬ СВР (1-32)-ЮН 3,21(2.02-5.43) 2. Ня 3-гЬ СВР (1-32) -БН 2.15(1.12-4,41) 3, Нв, В 1 е -гЬСВР (1-32)-НН 3.22(2.12-5.33) Таблица 2 Сравнительная активность соединений,полученных в условиях предлагаемогоспособа, с активностью ЬрСВР (1-40)-ОНпринятой заООХ Сравнение, 7 Пептид Ьр СВР (1-40) -ОН (стандарт)И 1 е 1 -гЬ СВР (1-29) -ННР-Туг "0 -тЬ СВР (1-29) -ЮНТут -гЬ СВР (1-29)-ИНаН 1 е 3 -гЬ СВР (1-32)-ИН1.ец, Н 1 е Д -гЬ СВР (1-29) -НН1 И 1 едД- гЬ СВР (1-32) -ИННояД - Ьр СВР (1-32) -НННд.в, Н 1 е 1- Ьр СВР (1-32)-ИНгЬ СВР (1-43)-ОНгЬ СВР 1 Ча 1" -ИН,Составитель В. ВолковаРедактор М. Петрова Техред М.Дидык Корректор М. Пожо Заказ 2169/58 Тираж 339 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 Х - 2-хлорбензилоксикарбонил,тХ- .мола-носитРль;