Способ получения иммуносорбента

(19) 03) СПУБЛИК у 511 А 61 К 4 ева и ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И 07 НРЫТЮ ОпиСАнйе изОБР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Пермский государственный медицинский институт и.Пермский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт. вакцин и сывороток(56) 1; Авторское свидетельство СССР Ю 6 У 814, кл. а 61 К 47/00;,1977.2; Хавкин 6. А., Булыгин Н. Г. Био специфическая аффинная сорбция и его применение в иимунологии. Уфа, 198, с, 3-16.3. Чо 1 к его, Сп геей.еп. Асйа. ра 1 Ь. ей, ш 1,сгоЬо 1. Ьсапдпач 1955,37Юг, 211-и 8.Ь 4) Ь/) 1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИИУНОСОРБЕНТА путем связывания антигена с носителем, о т л и ч а ю щ. и й с в тем, что, с целью повышения стабиль.- ности в качестве антигена используютфосфолипидный антигвн и связывание осуществляют обработкой носителя смесью раствора антигена в хлороформе и 0,5+О,01 раствора полиметилметакрилата в хлороформе при объем" нои соотношении носителя и указанной сиеси 1:1 с последующим высушиванием. полученного продукта.2, Способ по и. 1, о т л и ч а ю- щ и й с я тем, что используют фос" Фолипидные антигвны риккетсий или хламидий.3. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в кайестве носителя используют полиакриламидный гель или растворииый крахиал, или .сефарозу 4 В.07 б 76 10Изобретение относится к медицине,а именно к медицинской чикраЬиологиии может быть использовано для выделения специфических антител, применяемых в диагностике ряда инфекционныхзаболеваний,Известен способ получения иммуносорбента путем обработки кремнийсодержащего, неорганического носителяу-аминопропилтриэтоксисиланом, модификации полученного носителя глутаровым альдегидом с последующимковалентным связыванием его с белком. Иммуносорбент применяется длявыделения чистых антител из сыворотки 1 1 .Однако кратность использованияиммуносорбента составляет 5-8,Известен способ получения иммуносорЬента путем включения антигена в1 полиакриламидный гель проведениемсовместной полимеризации акрильныхмономеров с общей концентрацией ихдо 12/ в присутствии антигена и инициаторов полимеризации с последующейдополнительной сшивкой предварительно Фиксированного антигена глутаровымальдегидом. Вводимый в гель актиген в данном случае используют в виде следующего комплекса - дифтерийный токсин- антитоксин из нативнойкультуральной жидкости дифтерийнойпалочки и нативной противодифтерийной сыворотки 2 1.Однако способ не обеспечивает высокой стабильности получаемых иммуносорбентов. В процессе использования после 10-13 кратного использования значительно снижается их специфическая активность, что связано какс ухудшением колоночных свойствинертного носителя, так и недостаточно прочной Фиксацией на нем антигена.Цель изоЬретения - повышение стаЬильности получаемого иммуносор, Ьента,Поставленная цель достигаетсяспособом получения иммуносорЬентапутем связывания с носителем, гдев качестве антигена используют ФосФолипидный антиген и связываниеосуществляют оЬработкой носителясмесью раствора антигена в хлоФорме и 0,5+0011,-го раствора полиметилакрилата в хлороформе приобъемном соотношении носителя и указанной смеси 1;1 с последующим высушиванием полученного продукта.( 10 15 2 О 25 35 ". Ф 45 Я Я 2Предпочтительно используют фосФоли пидные анти гены ри ккетсий илихламидий,В качестве носителя обычно используют полиакриламидный гель, илирастворимый крахмал, или сефарозучв.СпосоЬность Фосфолипидных антигенов растворяться в хлоРоформе, неменяя своей специфической активности, дает возможность иммобилизовать их на носителе с помощью растворенного в хлороформе полиметилметакрилатаплексигласа), В результате достигается не только прочнаяФиксация антигена на носителе, но иза счет плексигласа значительно улучшаются колоночные свойства инертного носителя- увеличивается его стабильность. Кратность использованиядо 53 ргэ. В качестве исходного материала для извлечения Фосфолипидныхантигеков используют желточкые мешкикуриных эмЬрионов, инфицированныхсоответствующими микробными штаммами,например, возЬудителем сыпного тифариккетсиями Провачека. Желточныемешки гамогекизирют и из гомогенатаизвлекают антигек по известной методикеП р и м е р 1. Приготовленный антигек растворяют в хлороформе из расчета 1 мл на 1 желточный мешок. Послечего его смешивают с равным объемом 0,54 раствора плексиг.паса в хло"роформе. Ранее готовят полиакриламидный гель 1,50 мл). С этой цельюйй- метилек-Ьис-акриламид 1,б 25 грастворяют в 25 мл дистиллированной воды при 40 ОС в течение 30 мин,К полученному раствору добавляют2,5 г акриламида, затем последовательно вносят инициаторы сополимеризации: 0,05 г персульфата аммония и0,25 мл 101 раствора на дистиллированной воде М, И, Н, й - тетраметилэтилендиамина, Приготовленный полиакриламидный гель измельчают, просеивая через капроновое сито, промывают ацетонам и хлороформом, Затемк однсму объему носителя - полиакриламидному гелю доЬавляют равныйобъем полученной смеси антиген -плексиглас тщательно перемешиваюти высушивают в токе воздуха до исчезновения запаха растворителя. Полученный иммуносорЬект используют длявыделения антител к риккетсиям Провачека (пример 2). Аналогичным оЬра7676 фние 30 мин, После, полного отмывания физиологическим раствором рН 7,0несвязавшегося белка, сорбированныеантитела элюируют, Элюцию проводятодним из общепринятых способоввчастности 0,1 М буферным растворомКС 1 - глицина при рН 2,5 с последующей нейтрализацией раствора.Выделенные "чистые" антитела к 10 риккетсиям Провачека оЬладают высокойудельной специфической активностью.Коэффициент очистки составляет 44,5,При этом Ьедок определяют на спектрофотометре СФ, а ГЕ (гемогглютини рующая единица) определяют в реакциинепрямой гемогглютинации.Т а б л и ц а 1 Содержание белка в мг УдельнаяактивностьГЕ на мгбелка Коэффициенточистки (отношениеудельной активности"чистых" антител кудельной активностиисходной сыворотки) Специфическая активность вГЕ хмл Исходная25,6 160 4096 Сывороткапосле иммуносорбции 1,984 157,2 312 Выделенные "чистые" ан 1,924 44,5 2192 1139,3 титела П р и м е р 3. Получение иммуносорбента для выделения чистых антителк риккетсиям Музера,Исходным материалом для получе-,ния фосфолипидного антигена служат инфицированные риккетсиями Музера штамм "Исаханян" желточные оЬолоч/ки куриных эмбрионов -(титр возЬудите ля 10 , ПД -. 02 мл при введении вжелточный мешок Желточные оЬолочкигомогенизируют и из гомогена извлекают антиген по методу3 . Полученныйантиген растворяют в хлороформе из 5 Орасчета 1 мл на 1 желточный мешок.Затем его смешивают с равным объемом054 раствора плексигласа в хлороформе. Ранее готовят полиакриламидный гель, как описано выше. Приготовленный полиакриламидный гель измельйают, просеивая через капроновое сито, промывают ацетоном и хлороформом. 3.100зой готовят иммуносорбенты на Фосфо,липидных антигенах других микробов,например хламидий.П р и м е р 2. Выделение антителк риккетсиям Провачека из лошадинойантисыворотки,Сухой имиуносорбент суспендируют в физиологическом растворе рН /,0 и заполняют колонку (100 ммх 25 мм). Колонку симмуносорбентом промывают физиологическим раствором рН .7,0 до нулевой экстинкции. На колонку наслаивают антисыворотку к риккетсиям Провачека и пропускают ее через слой иммуносорбента в течеЗатем к одному объему носителя - по"лиакриламидному гелю добавляют равный .оЬъем полученной смеси антигенплексиглас, тщательно перемешиваюти высушивают в токе воздуха до исчезновения запаха растворителя. Иолу"ценный иммуносорбент используют длявыделения препаратов к риккетсиям Музера,П р и м е р 4. Получение иммуносорбента для выделения чистых антителк риккетсиям СибирикаВ качестве исходного материаладля получения фосфолипидного антигена применяют инфицированную рик-.кетсиями Сибирика штамм Ктканьселезенки и брюшины белых мышей,зараженных внутрибрюшинно. Передзаражением белым мышам весом 16 18 г(за 4-5 ч) внутримышечно вводятГиДрокортизон по 2,5 мг нд ОДну5 100767мышь. Накопление возбудителя конт".ролируют микроскопией мазков-отпечатков, окрашенных по РомановскомуГимза. В опыте используют материал с 3-4"х крестным накоплением возбу дителя. Извлечение антигена осуществляют по методу Г 3 . Полученный антиген растворяют в хлороформе из расчета 1 мл на органы от одной белой мыши. Последующие этапы получе.ния иммуносорЬента проводят, как ука. зано в примере 1.ЮП р и м е р 5. Получение иммуно" сорбента для выделения чистых антител к возЬудителю энзоотическогоаборта овец.Исходным материалом для извлечения фосфолипидного антигена служат желточные оболочки куриных эмЬрионов, зараженных возбудителем энзоотического аборта овец штамм ЕАЕ. Титр возбудителя должен быть не менее 10 ЯДО(0,2 мл при зара 6жении в желточный мешок ). Выделение антигена и получение иммуносорбента проводят, как указано в примере 1.П р и м е р 6, Получение иммуносорбента для выделения чистых антител к возбудителю венерической лимфогранулемы. 39Для получения фосфолипидного анти- гена используют желточные оболочки развивающихся куриных эмбрионов, . инфицированных возЬудителем венерической лимфогранулемы штамм ЛГВ. зю Титр возЬудителя в исходной взвеси . должен составлять 10 ЛД 5,(0,25 мл при введении в желточный мешок),. Да". льнейшая обработка материала и получение иммуносорбента осуществля ется , как указано в примере 1.П р и м е р 7Получение иммуносорбента на основе сефарозц 4 В. для выделения антител к К. ргоиайеКиИз желточной культуры риккетсий м Провацека готовят фосфолипиднцй антиген (методика примера 1).Полученный антиген растворяют в хлороформе,. иэ расчета 1 мл на 1 желточнцй мешок Растворенный антиген смешивают с рав- М ным обьемом 0,51 раствора мелкойстружки полиметилметакрилата в хлороформе. Приготовленную смесь соединяют с равным объемом сефарозы 4 В (фирма РЬагвас 1 а),предварительно. обезжиренной хлороформомПолученную смесь тщательно перемешивают и высушивают в токе воздуха до полного ис". чеэновения запаха растворителя. Получение иммуносорбента проводят при 18 22 С.П р и м е р 8. Получение иммуносорбента на основе сефарозы 4 В для выделенияантител к СЬ. рз 11 йас 1.Из желточной культуры возбудителя орнитоза, тем же способом гота" вят фосфолипидный антиген. Полученный антиген растворяют в хлороформе иэ расчета 1 мл на 1 желточный мешок. Остальные операции проводят та ким же образом, как в примере 1.П р и м е р 9 . Получение иммуносорбента на основе крахмала растворимого (ГОСТ 1063-62, Реахим) для выделения антител к В. ргоиагейцИз желточной культуры риккетсий Провачека готовят, Фосфолипидный антиген(тем же способом). Полученный антиген растворяют в хлороформе из расчета 1 мл на 1 желточный мешок. Растворенный антиген смешивают с равным обьемом 0,54 раствора мелкой стружки полиметилметакрилата в хлороформе. Приготовленную смесь соединяют с равным обьемом крахмала растворимого, предварительно обезжиренного хлороформом. Полученную смесь тщательно перемешивают и высушивают в токе воздуха до полного исчезновения запаха растворителя, Все перечисленные операции проводят при 18-22 чС.П р и м е р 1 О. Получение иммуносорбента на основе крахмала растворимого (ГОСТ 1063-62. Реахим) для выделения антител к СЬ, рз 1 ССас 1.Все операции проводят аналогичным образом с той лишь разницей, что работают,с Фосфолипидным.антигеном возбудителя орнитоза.Для извлечения специфических антител соответствующий иммуносорбент суспендируют в физиологическом растворе рН 7,0 и заполняют колонку. Пос" ледующие этапы работы изложены ранее (пример 2).В табл. 2 приведены результаты сравнительного применения иммуносорбентов., приготовленных на основе различных инертных носителей, для: выделения антител к риккетсиям Провачека и хламидиям орнитоза.,Таблица 2 е Инертный носитель (основа иммуносорбента) Удельная акти вност ь выделенных ант тел, ГЕ/мг белка Удельная активность исходной сыворотки,ГЕ/мгбелка Иммуннаясыворотка ав т е в в и ч в а ей а ае е 4 Ь а Полиакриламидный гель К риккетсияПровачека 32,1 25 6,51 Сефароэа 4 25,5 536 31,9 Крахмал воримый К риккетсиям 29 Провачека хламидия рнитоза24,684120 Сравнительные данные по стабильно сти получаемых иммуносорбентов (носитель - полиакриламидный гель) приведны в табл, 3.Т а б л и ц а 3ВЮ еа приготовленные аются достаточческой активИммуносорбе ратно ть исполь- зования 12 51 ыделениялю орнитоза 9 выделения антузера Иммуносорбент для выделения антител к риккетсиям СибирикаИзвестный способПредлагаемый -РтИммуносорбент для выделения антител к возбудителю энэоотического аборта овецИзвестный способПредлагаемый -"- жвв и е е К хламидияморнитозаК риккетсияПровачекаК хламидияморнитоза Таким образом вс .иммуносорбенты отли но высокой специф костью,Иммуносорбент для выделенияантител к риккетсиям ПровачекаИзвестный способПредлагаемый Иммуносоовбент для антител к возбуди Известный способ ПредлагаемыйИммуносорбент для тел к риккетсиям Известный способ Предлагаемый -"оэффициент очист. и (отношение удель" ой активности антиел к удельной актив- ости исходной сыворотки)9 100767610В табл. 4 приведены результаты кетсиям и хламидиям орнитоза в сравмногократного применения иммуносор- нении с иммуносорбентами, полученны" бентов для выделения антител к рик- ми известным способом,Т а б л и ц а 4 Специфическая активность "чистых" антител Оикл сорбции элюции к хламидиям орнитоза к риккетсиям Провачека Предлагаемый Известный Предлагае- Известный . мый иммуно иммуносорсорбент бент иммуносорбент.- йе юю ггСпецифическая активность полученных антител измеряли в ГЕ х мл (из в мерение не проводилось).Таким образом предлагаемые иммуносорбенты сохраняли специфическую активность несмотря на многократное использование, На протяжении длитель-з ного срока наблюдения с их помощью удавалось получить достаточно высокий, практический однозначный уровень специфических антител, Иммуносорбенты, полученные известным способом после 1013 кратного примене" ния из-за недостаточной механической прочности и ухудшения колоночных свойств теряют специфическую активность.Техникоиокономическая эффективность заключается в возможности получения иммуносорбентов, обладающих высокой стабильностью и возможностью многократного использования,Составитель О, СкородумоваТехред С.Мигунова Корректор И, Шарфйигиии еювви ееюаюееевюювааиеееюива югеивваге 4 Редактор Е. Лушникова ею ююеи юга ааЗаказ 2177/6 Тираж 711 Подписное ВНИИПИ Государственного, комитата, СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, К, Раушская наб., д. 4 Яюа а в аю е в аа ав ю е юв гФилиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул; Йроектная, 4 е юв и е