Способ выделения фосфоинозитида из соевых фосфатидов

(22) Заявлено 04.07 80 (21) 2952230/23 М. Кл.С 07 Е 9/1 нрисоединением заявки М Воударотоеииб онитот СССР оо долам изобретений н открытий) Заявитель евосточный государственный университет 54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФОСФОИНОЗИТИДА ИЗ СОЕВЬ ФОСФАТИДОВ1Изобретение относится к химии фосфор- органических соединений, а именно к способу выделения фосфоинозитида из соевых фосфатидов, который находит широкое применение в изучении структуры и функции мембран, его роли в нервной ткани, в медицине и фар-макологии.Известен способ получения фосфоинозитида, заключающийся в экстракции говяжьего мозга последовательно ацетоном,. метанолом, петролеиным эфиром, с многократным переосажде.10 нием в эфире-ацетоне для получении кефали- новой фракции, которую смешивают с дистил. лированной водой и подвергают диализу 4 сут, далее из нее получают фосфоинозитидную фракцию хлороформ-метанольным методом с последующим многократным переосаждением фракции из хлороформ-метанольной смеси, диализом, лиофилизацией, переводом в Йа-соль зтилендиаминотетрауксусной кислотой и пропусканием. через колонку с СЬеЬх - 100(йа.форма) и последующим получением фос. фоинозитида на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой и дополнительной доочисткой его от фосфатидилсерина, Из 850 г мозга получают 217 мг смеси фосфоинозитида с фосфатидилсерином, что составляет около 0,03% от исходного субстрата (Ц.Однако способ требует длительной (около 7 - 9 рабочих дней) и сложной (многократное переосаждение, диалю, лиофилизация, очистка на ионообменной: смоле переведенной в йа-форму фракции) процедуры получения фосфоинозитидной фракции и дополнительной процедуры для отделения фосфоинозитнда от фос. фатидилсерина.Известен способ выделения фракций фос. фоинозитидов ю ткани головного мозга, заключающийся в получении липидного экстракта петролейным эфиром ю мозга, обезвоженного ацетоном, хлороформ. метанолом (1:9), этано. лом, растворении липидов в хлороформ. метанольной системе с добавкой соляной кислоты, перемешивании, центрифутировании и получении фракции кислых фосфолипидов, освобождением липидного экстракта от ионов двухвалентных металлов и фосфолипидов, имеющих основные группы, на Дауэкс - 50 (Н форма), с последую з 950730щим делением фракции на ДЕАЕ.целлюлозедля удаления полифосфоинозитидов и получении фракции, содержащей монофосфоино.зитид, с последующим переводом ее в Ма+форму на колонке с Дауэкс - 50 (Н-форма) идальнейшим разделением на А,Оз для полу.чения монофосфоиноэитида в йа.форме. Моно.фосфон нозитид дочищают от возможныхпримесей петролейным эфиром или изопропиловым сром. Из 1 кг ткани головногомозга получают 1 г фосфоинозитида, т,е,около 0,1% от исходного субстрата 2).Недостатками этого способа являются еготрудоемкость и многостадийность при получении фосфоинозитидной фракции для после.дующего хроматографического разделения -экстракция ацетоном, хлороформ-метанолом,этанолом, петролейным эфиром, получениефракции кислых фосфолипидов на Дауэкс - 50,частичная очистка их на ДЕАЕ-целлюлознойколонке, перевод в Ма-форму на колонКе20с Дауэкс - 50 и дополнительная доочистка продукта от возможных примесей, Выход конечного продукта относительно невысок,Наиболее близким по технической сущностии достигаемым результатам к предлагаемому25является способ выделения фосфонозитида изсоевых фосфатидов путем последовательнойэкстракции фосфолипидов хлороформом иметанолом с последующей хроматографическойочисткой на силикагеле. Из 5 г фосфолипидов ЗОэтим способом получают 200 мг целевогопродукта 31.Недостатком этого способа является невысокий выход целевого продукта.Цель изобретения - увеличение выхода целевого продукта,Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения фосфоинозитида изсоевых фосфатидов, соевые фосфатццы под.вергают последовательной экстракции ацетоном и хлороформ-метанолом, отмывают экстракт водой, смешивают его с окисью алюминия в весовом соотношении 1:8 и подвергаюточистке на колонке с сухим смешанным сор.бентом - смесью силикагеля с диэтиламиноэтилцеллюлозой, взятых в весовом соотношении1:1.Предлагаемый способ позволяет увеличитьвыход целевого продукта до 80% от исходного количества фосфоинозитида в соевых фософатидах или 2,6% от исходного количествасубстрата.П р и м е р 1. Получение фосфоинозитидаиз коммерческих соевых фосфатидов,Получение экстракта.50 г коммерческих соевых фосфатидовотмывают от нейтральных липидов ацетоном5 раз (фосфатиды-растворитель 1;5), остаток экстрагируют 1 раз хлороформ. метанолом(1:1) (фосфатиды-растворитель 1:10), Хлороформ-метанольный экстракт отмывают дистиллированной водой (1/5 часть от объема экстракта), Водный слой отбрасывают. Нижнийхлороформ-метанольный слой используют длявыделения фосфоинозитидной фракции. Из50 г коммерческих фосфатидов получают 24 гобщих липидов, из них фосфолипиды составляют 59%, В состав фосфолипидов входят,%:фосфоинозитид 12; фосфатидилэтаноламин29,5; фосфатидилхолин 36,7; фосфатиднаякислота 8,8; фосфатидилглицерин 2,3; поли.глицерофосфатиды 2,2; дифосфатидилглицерин 2,2; дифосфоинозитид 1,7; лизофосфати.дилхолин 2,1%.Выделение фосфоинозитидной фракции.Общий липидный экстракт доводят до концентрации 30 мг/мл хлороформ-метанолом 1:1(24 г общих липидов растворяют в 720 млсистемы), смешивают с 200 г окиси алюминия(1 40/250 И, щелочной, для хроматографии,Чехословакия; соотношение сорбент : липиды8:1), выливают в воронку Бюхнера и элюируют лецитиновую фракцию 3,6 л хлороформметанола (1:1), отсасывая ее вакуумным, насосом в колбу Бунзена. Фракцию отбрасывают,1Фосфоинозитидную фракцию (фосфоинозитид,фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин,полиглицерофосфатиды, дифосфатидилглицерин,дифосфоинозитид и гликолипиды) элюируют12 л хлороформ-метанола (1:1) с добавкой15% от объема 1%-ного водного уксуснокислого аммония (фосфатидная кислота этойсистемой не элюируется), К полученной фракции добавляют 1/5 часть дистиллированнойводы, После отстаивания верхнюю водную фазу отбрасывают, Нижнюю хлороформную фазу концентрируют досуха на роторном испарителе. Выход фракции 6,38 г.Выделение фосфоинозитида.5 г фосфоинозитидной фракции растворяютв 80 мл хлороформа, смешивают с 40 г силикагеля марки 1. 100/250 и (Чехословакия),высушивают на роторном испарителе до сыну.чего состояния и засыпают на сухую колонкусо смешанным сорбентом - ДЕАЕ-целлюлозас силикагелем в соотношении 1 г исходнойфосфоинознтидной фракции на 80 г сорбента,Подготовка колонки,ДЕАЕ-целлюлозу (бисерный полимер, анионит, Венгрия) предварительно замачивают на30 мин в 1 н. НСК промывают последовательно 1 н, раствором НСг, водой и 1 нрастворомгидроокиси натрия, трижды повторяют такуюобработку, тщательно промывают один разметиловым спиртом, помешают в ледянуюуксусную кислоту на 1 сут, после чего отмывают метанолом до нейтральной рН. К гото950730 6 5вой ДЕАЕ-целлюлозе в метаноле добавляют равное количество силикагеля марки Л 40/100/Й (Чехословакия), хорошо перемешивают и сра- . зу же выливают в воронку Бюхнера, растворитель отсасывают вакуумным насосом в кол-, 5 бу Бунзена, после чего смешанный сорбент су. шат в сушильном шкафу прн температуре не более 70 - 100 С до сыпучего состояния.400 г готового сорбента засыпают в колонку (отношение диаметра колонки к высоте сор.10 бента 1:1 - 1:2), слегка уплотняют, затем засы. лают фосфоинозитидную фракцию, смешанную с силикагелем и сверху присыпают силика. гелем марки .1. 100/250 (Чехословакия) слоем 3 - 5 см, наверх кладут фильтр. 15Для элюции используют:а) 2 колоночных объема (0,8 л) хлорофор.б) 10 колоночных объемов (4,5 л) хлороформ-метанола 8:2. 20Первые 3 колоночных объема (1,3 л) содержат гликолитпщы, нейтральные липиды и фосфатидилэтаноламин, Оставшимися семью кола- ночными объемами элюируют фосфатидилэтаноламин с чистотой около 97%. Выход фосфати дилэтаноламина 2 г.в) 6 колоночных объемов (2,75 л) хлоро. форм-метанола 2:8 используют для дочистки колонкиг) 9,3 колоночных объемов (4 л) хлороформ-метанол - 25% аммиак 65:25:5. Первые 6 колоночных объемов, содержащие полиглицерофосфатиды, фосфатидилглицерин, дифосфатидилглицерин и следы фосфоинозитида, отбрасывают. Оставшимися 3,3 колоночными объемами вымывают фосфоинозитид. Выход35 продукта 1 г с чистотой 99%, что соответствует 80% от исходного количества фосфоино зитнда в соевых фосфатидах или 2,6% от исходного количества субстрата..П р и м е р 2. Получение экстракта про 49 водят как в примере 1. Выделение фосфоинозитидной фракции про-: водят, как в примере 1. Соотношение липщт-ного экстракта и окиси алюминия (40/250 р 45 щелочной, Чехословакия) 1:3 (г/г). 24 гобщего липидного экстракта в 800 мл хлороформ.метанола (1:1) смешивают с 72 гокиси алюминия. Выход фосфоинозитиднойфракции 1,92 г (в 3,3 раза меньше, чем в 50 примере 1), В состав фосфоинозитидной фракции входят фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин, дифосфатиднлглицерин, полиглицеро, фосфатиды, фосфоинозитнд и фосфащддая кислота. 55Выделение фосфоннозитида.Полученную фосфоинозитидную фракцию(1,92 г) растворяют в 20 мл хлорофбрма,смешивают с 15 г силикагеля ( 100/250 и,(Чехословакия), высушивают на роторном ис. парителе до сыпучего состояния и засыпают на колонку (как в примере 1) со 100 г сме шанного сорбента - ДЕАЕ - целлюлоза с силикагелем в соотношении 1:1, приготовленного как в примере 1. Соотношение фосфоинозитидной фракции и сорбента 1:55 (г/г),Для элюции используют:а) 5 колоночных объема (0,7 л) хлороформа.б) 20 колоночных объемов (2,8 л) хлороформ-метанола 8:2.Первые 7 колоночных объемов (1 л) содержат глнколипцц, нейтральные липиды и фосфатидилэтаиоламин. Оставшимися объемами элюируют 600 мг фосфатидилэтаноламина с чистотой 92%.в) 8 колоночными объемами (1,15 л) хлороформ-метанола 2:8 домывают колонку.г) 17 колоночных объема (2,4 л) хлороформ-метанол - 25% аммиак 65:25:5. Первые 8 колоночных объемов, содержащие полиглицерофосфатид, фосфатидилглицерин, фосфоинозитид, фосфапщную кислоту, отбрасывают. Оставшимися 9 колоночнымн объемами вымывают фосфоннозитид с примесью фосфатид. ной кислоты. Выход 130 мг с чистотой 70%. Выход составляет около 8% от исходного количества фосфоинозитида в соевых фосфатидах. П р и м е р 3. Экстракт получают, какв примере 1.Выделение фосфоинозитидной фракции.Процедуру выделения выполняют, как впримере 1.24. г общего липидного экстракта в 800 млхлороформ-метанола (1:1) смешивают с 150 гокиси алюминия. Соотношение общего липидного экстракта и окиси алюминия 1;6 (г/г).Выход фосфоинозитидной фракции 2,88 г(в 2,2 раза (45%) ниже, чем в примере Ц.Состав фосфоинозитидной фракции, как впримере 2.Вьщеление фосфоинозитида проводят по про.цедуре примера 1,Соотношение фосфоинозитидной фракциии сорбента 1:40 (г/г). 2,88 гфосфоинозитидной фракции отделяют на колонке с 120 гсорбента.Для элюции используют:а) 2 колоночных объема (0,36 л) хлороформа.б) 5 колоночных объемов (0,9 л) хлороформ-метанола 8:2.Первые 2 колоночных объема отбрасывают,Оставшимися объемами элюируют фосфатидил.этаноламинс фосфоинозитидом. Выход фосфатиднлэтаноламина 1 г, чистота 90%.в) 6 колоночными объемами (1,1 л) хлоро.форм-метанола 2:8 домывают колонку,50730 9г) 16 колоночных объема (2,8 л) хлоро. форм. метанол - 25% аммиак 65:25:5, Первые 8 колоночных объемов, содержащие полиглицерофосфатиды, дифосфатидилглицерин, фосфатидилглицерин, фосфоинозитид, фосфатидную кислоту, отбрасывают. Оставшимися объемами вымывают фосфоинозитид с примесью фосфатидной кислоты. Выход 200 мг с чистотой 90%, что составляет 12% от исход ного количества фосфоинозитида в соевых фосфатидах,П р и м е р 4. Экстракт получают, как в примере 1.Вьщеление фосфоинозитидной фракции.24 г общего липидного экстракта в 800 мл хлороформ-метанола (1:1) смешивают с 480 г окиси алюминия, Соотношение общего липидного экстракта и окиси алюминия 1:20 (г/г). Далее процедуру выполняют, как в .примере 1, Выход фосфоиноэитидной фракции 6,24 г, Состав фосфоиноэитидной фракции, как в примере 1.Выделение фосфоинозитида проводят, как в примере 1.Выход 1 г с чистотой 99%, что соответствует 80% от исходного количества фосфоинозитида в соевых фосфатидах. П р и м е р 5, Экстракт получают, какв примере 1,Выделение фосфоинозитидной фракции проводят по процедуре примера 1,Выделение фосфоиноэитида.5 г Фосфоиноэитидной фракции смешиваютс силикагелем . 100/250/и, (Чехословакия),как в примере 1,Подготовка колонки.ДЕАЕ-целлюлозу готовят, как в примере 1,К готовой целлюлозе в метаноле цобавляют2 части (от количества ДЕАЕцеллюлозы)силикагеля марки . 40/100 и. (Чехословакия),далее как в примере 1,400 г готового сорбента засыпают в колон.ку, слегка уплотняют, засыпают фосфоино.зитидную фракцию, смешанную с силикаге.лем. Соотношение сорбента и фосфоинозитид.ной фракции 80:1.Для элюции используют схему по примеру 1.Выход фосфоинозитида 1 г, чистота 99%. П р и м е р 6. Экстракт получают, какв примере 1.Выделенйе фосфоинозитидной фракции проводят, как в примере 1.Выделение фосфоиноэитида,5 г фосфоиноэитидной фракции смешиваютс силикагелем100/250 р, (Чехословакия),.-Аак в примере 1.Подготовку колонки проводят, как в примере 1. К готовой ДЕЛЕ.целлюлозе в метаноле добавляют 4 части (от количества ДЕАЕцеллюлозы) силикагеля40/100 ц (Чехословакия) и далее процедуру выполняют, как впримере 1. Соотношение фосфоиноэитиднойфракции и сорбента 1;80 (пример 1),Для элюции используют:а) 2 колоночных объема (0,8 л) хлоро.форма.б) 10 колоночных объемов (4,5 л) хлоро 1 о форм-метанола 8:2, Фосфоиноэитид элюируется совместно с гликолипидами, нейтральнымилипидами, фосфатидилэтаноламином.Для получения чистого фосфоинозитида ко.лонка не годится.Л р и м е р 7. Экстракт получают, какв примереВыделение фосфоинозитидной фракции проводят, как в примере 4.Выделение Фосфоинозитида.5 г фосфоинозитиднои фракции смешиваюг с сипикагелем, как в примере 1,Подготовку колонки проводят, как в примере 1. К 5 частям готовой ДЕАЕ-целлюлозыдобавляют 1 часть силикагеля 1. 40/100 и.25 (Чехословакия), далее пооцедуру проводят какв примере 1. При этом колонка имеет рыхлуюупаковку сорбента и происходит проскок вещества уже с хлороформа.Для элюции используют:зо а) 2 колоночных объема (0,8 л) хлоро.форма: наблюдают проскок фосфоинозитидауже в хлороформе.б) хлороформ. метанол 8;2, Фосфоинозитидэлюируется с фосфатидилэтаноламином, нейтральными липидами, гликолипидами.Для получения фосфоинозитида колонка негодится.П р и м е р 8. Предварительные процедуры,как в предыдущих примерах.Выделение фосфоинозитида как в приме 1,Соотношение ДЕАЕ-целлюлозы и силикагеля 10:1 (г/г), При элюции с колонки на.блюдается проскок фосфолипидов уже в хло.роформе и далее разделения не происходит. Поэтому для вьщеления фосфоиноэитида такаяколонка не годится. Формула изобретения 5 ОСпособ выделения фосфоиноэитида из соевых фосфатидов, включающий экстракцию фосфолипидов хлороформом и метанолом и очистку фосфоинозитида силикагелем, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, соевые фосфатиды подвергают последовательной экстракции ацетоном и хлороформ-метанолом, полученный экстракт отмывают водой, смешивают его сСоставитель М, КрасновскаяТехред М. Надь Корректор С. Шекмар Редактор Н, Киштулинец Тираж 388 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам. изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5Заказ 5892/27 Подписное Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 9 950730 0окисью алюминия в весовом соотношениидгафепт ва 1 т ептоп 1 и а пхес во 1 чепт вувтегп,1:8 и подвергают очистке на колонке с су- .1. о 1 Во СЬев, 1964, 239, 1369 в 13.хим смешанным сорбентом - смесью силика- . 2. Киселев Г. В, Препаративный метод полугеля с диэтиламиноэтилцеллюлозой, взятых в чения фракций фосфоиноэитидов из ткани говесовом соотношении 1:1. ловного мозга, - "Биохимия", 1977, 42 (12),Источники информации, с. 2202-2205,принятые во внимание при экспертизе1. Непдпс 1 своп Н. 3. апс Ва 5 Ьо С. Е.,оп 3, 6. Соасссо, пз. Варрог, Э. ЕЬО Вев.ехсЬапде сЬгопзатодгарЬу о 1 пласт Ьгаи рЬов - А втр 1 Жес ргерагатоп о 1 рЬоврЬатйуро 1 повткев оп ЖетЬу 1 апипоетЬу се 1 цове Ьу - 10 повтоВ.1967, 8, (5), 513 - 515 (прототип).