Способ хроматографического разделения смесей метиловых эфиров метилгликопиранозидов

О П И С А Н И Е ( )765278ИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветсиикСоциалистическихРеспубликата опубликования описания 25,09,80 вакумов, О, В. Свиридовтрельченок А крем, Г. В иО.А2) Авторы изобретения нстнтут биоорганической химии АН Белорусской ССР(54) СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСЕ МЕТИЛОВЫХ ЭФИРОВ МЕТИЛГЛИКОПИРАНОЗИДОВ тделения ин Настоящ усовершенс рафического эфиров мети необходимы ниях полиса цепей, вход полимеров,Известенметиловых тилового э например .Ф препаратив рафии 1 с рокс ильных ее изобретение относится к твованному способу хроматогразделения смесей метиловыхл гликопиранозидов, которыепри структурных исследовахаридов и алигосахаридных5 ящих в состав смешанных биов частности гликопротеинов.способ разделения смесей эфиров (ди-, три-, и тетраме1 О фиров) метил гликопираноэидов-метил- ц -маннозидов путем ой гаэожидкостной хроматогмодификацией свободных гицгрупп.5 Нецостатками этого метода являются необходимость дополнительной модификации свободных гидроксильных групп в триметиловых эфирах со снятием защитных группировок после разделения; низкая летучесть монометиловых эфиров и необходимость их перевода в о-ацетильные производные с последующим снятием ацетильных защит после вьдивицуальных компонентов.Целью изобретения является упрощение процесса.Это достигается использованием для разделения смесей метиловых эфиров ме тилгликопиранозидов копоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии на силикагеле с градиентным элюированием системой метанол-хлороформ, что позволяет избежать дополнительных стадий модифи кации свободных гидроксильных групп триметиловых эфиров и ацетилирования монометиловых эфиров метилгликопираноэидов и последующего снятия защитных групг с индивидуальных соединений.На фиг. 1-7 представлены графики, иллюстрирующие предлагаемый способ.Способ хроматографического разделения смесей метиловых эфиров метилгликопираноэидов заключаетс я в колоночной жидкостно адсорбционной хроматографии на силикагеле с градиентным элюироввнием со скоростью 1,8-2,0 о 6.% в чагИдя контроля за кодом разцеления и опрецеления момента окончания опыта (выхоца посдеанего вещества) каждую50 пятую фракцию анализируют методом ГЖХ; после завершения кодоночной хроматографии проводят анализ всех осталь ных фракций и строят кривую деления (фиг.1). Как вилно из фиг. 1, на этой55 стадии достигалось выделение чистого тетраметилового эфира и четкое групповое разделение три-, ци- и монометицовых эфиров,3 7 системой метанол-хлороформ при увеличе нии концентрации метанола от 0 цо 4-6 об.% цля тетраметиловых эфиров от 5-6 цо 7-8 об,Ж пдя суммарной фрак ции триметиловых эфиров, от 7-8 цо 10-12 об.70 цля суммарной фракции циметиловых эфиров, от 10-12 ао 13- 15 об.70 цля суммарной фракции мономе тиловых эфиров с последующим разцелением суммарных фракций на индивииуальные компоненты путем 2-3-кратной рехроматографии на сидикагеде при увеличении концентрации метанола от 0 до 15 обЛ со скоростью 0,8-1,5 об.%.П р и м е р 1 , Групповое разделение смеси метиловых эфиров метил-Ы-Ъ -маннопиранозица.Сидикагель Л с размером частиц 40 - 100 мкм (ЛаХема, ЧССР) суспенцируют в хлороформе и дегазируют. Подученной суспензией заполняют стеклянную колонку с внутренним диаметром 3 см и высотой рабочей части 60 см, промывают силикагель несколькими колоночными объемами хлороформа.Примерно 3 г синтетической смесисодержавшей тетра-, три-, ци-, и монометиловые эфиры метилманнопиранозида растворяют в минимальном объеме смеси хлороформа с метанолом (9:1, по объему ) и наносят на силикагедь, Эдюцию осуществляют самотеком со скоростью протока через колонку около 150 мл/час, Пропускают через колонку 500 мл хлороформа и элюат отбрасывают. Затем эдюцию продолжают при повышении концентрации метанола, в элюенте со скоростью 1,8-2 об.% в час. (Грациент концентрации метанола задавали широко распространенным способом с помощ ю двух сообщающихся сосуцов). Отбрасывают еще 300 мл элюата, а затем начинают собирать его с помощью коллектора фракций. Время сбора фракции - 2 мин, что соответствует объему около 5 мл. 6527 8 фВыход (в расчете на 1 г смеси) тетраметилового эфира составил 190 мг,суммарной фракции триметиловых эфиров - 270 мг, суммарной фракции циметиловых эфиров - 320 мг и суммарнойфракции монометиловых эфиров - 200 мг(итого 980 мг). Таким образом, потери веществ на колонке пренебрежимомалы.10 После удаления растворителя длительным высушиванием на ротационном испарителе полученный тетраметиловый эфирпрецставдяет собой бесцветную густуюсиропообразную жидкость и по цанным15 аналитической ГЖХ в различных усло-виях примесей не содержит, Суммарнаяфракция монометиловых эфиров содержитпримерно равные количества всех четы.рех изомеров и не содержит каких либо20 посторонних примесей.П р и м е р 2. Выцедение инаивицуальных триметиловых эфиров метил-Ы-) -маннопиранозица,Примерно 0,5 г смеси триметидовых25 эфиров растворяют в смеси хлороформас метанолом (9:1, по объему) и наносят на колонку (циаметр 1,5 см, высота 90 см) с силикагелем. Тип силикагеля, размер частиц, пронецуры напод 50 нения и промывки колонки аналогичныописанным в примере 1. Скорость протока через колонку составляет90 мл/час,После нанесения образца пропускаютз 5 через колонку 250 мл хлороформа иэлюат отбрасывают. Ътем создают повышение концентрации метанола в элюенте от 0 цо 7,5% со скоростью 0,91,1 об,в час. Отбрасывают еще 400 мл40 эдюата, затем начинают сбор фракций.Время сбора фракции - 2 мин, что соответствует объему 3 мл. Анализ фракцийпровоцят как в примере 1. Кривая деления приведена на фиг. 2, жирными линия 45 ми поц осью абсцисс показано объединение фракций цля рехроматографии. фракции 4-10 и 26-30 содержат чистыекомпоненты, фракции 11 - 13, 14 - 16;17 - 22 и 23 - 25 поцвергают рехроматографии в условиях, описанных выше(фиг. 3 и 4).Полученные гомогенные триметиловыеэфиры после удаления растворителя представляют собой бесцветные густые сиропообразные жицкости и по данным ГЖХв различных условиях не содержат примесей. Ицентификацию полученных веществ гровоцят методом масс-спектрометрии,2,43,4,62,3 2,3 480 2130 5 7В табл. 1 приведены выходы триметиловых эфиров метил-о Э -маннопиранозида (в расчете на 1 г их смеси).Табл ица 1 65278 6тетра, три- и диметиловых эфиров метил-Ъ-галактопиранозида.Разделение проводят в условиях, описанных в примере 1. В расчете на 1 гсинтетической смеси получено 140 мгтетраметилового эфира (чистый по данным аналитической ГЖХ), 480 мг смеси триметиловык эфиров и 300 мг смеси диметиловых эфиров (без посторонник1 О примесей) - итого 920 мг.П р и м е р 5. Выделение индивидуальных триметиловых эфиров метил-Ф- Ъ -галактопиранозида.Условия разделения аналогичны опи 15 санным в примере 2.нньо природе полуэфиров метил(в расчете наах приведены в лактосмеси) 3, Все иным тиловых ченнь т г ихабл.по да пиранози д и их Выхсоединени ГЖХ в ра были гомоген ичных услови абл 2,3,6 2,3,4 2,4,6 185 5 346 5 того: 92,6 5 9 нировани П р и м е р 3, Выделение индивидуальных диметиловых эфиров метил-О(- -Ъ-маннопиранозида.Условия разделения диметиловых эфиров аналогичны описанным в примере 2, за исключением того, что элюцию веществ осуществляют при увеличении концентрации метанола от 5 до 10% со скоростью 0,8-0,9 об% в час. Ход разделени иллюстрируется фиг. 5-7 (на фиг, 5- первичное разделение смеси диметиловых эфи ров метил -К-Ъ-маннопиранозида; на фиг, 6 - рехроматография диметиловых эфиров метил-о(-Ъ -маннопиранозида; а - фракции 9-11, б - фракции 18-20, в - фракции 35-38; на фиг, 7 - рехраматография диметиловых эфиров метилО -Ъ -маннопиранозида: а - фракции21-27, б - повторная рехроматография фракции 23-26).Отнесение пиков и выходы диметиловых эфиров метил-о(-Ъ-маннопиранозида (в расчете на 1 г их смеси) приведены в табл. 2,Табл ица р 4. Первичное фракциоупповое разделение) смеси Способ хроматографического разделения смесей метиловых эфиров метилгликопиранозидов, о т л и ч а ю щ и й с я 45 тем, что, с целью упрощения процесса,используют метод колоночной жидкостноадсорбционной хроматографии на силикагеле с градиентным элюированием системой метанол-хлороформ со скоростью1,8-2,0 об.% в час при увеличении концентрации метанола от 0 до 4-6 об.%для тетраметиловык эфиров, от 5-6 до7-8 об % для суммарной фракции триметиловык эфиров, от 7-8 до 10-12 об.%для суммарной фракции аиметиловых эфиров, от 10-12 до 13-15 об. % для суммарной фракции монометиловык эфиров споследующим разделением суммарныхфракций на индивидуальные компонентыевра фрокино Фи,/ 7 765путем 2 3 кратной рехроматографии насиликагвле при увеличении концентрацииметанола от О до 1 5 об,% со скоростью0,8-1,5 об,% в час.Источники информации,принятые во внимание при экспертизеЧ 3 й 278 81,3 Ущ 1 м . и др. Аналитическаяи препаративная газо-жидкостная хроматография ди-, три- и тетраметиловогоэфира Ю -метил-Ъ -маннозида, 1,0 ФСЪЬ765278 Иоиеро францифиг.Х исмеро франите аефф %Шек мер 4 а Фг аэ 6445/25 Тираж 495ВНИИПИ Государственного комипо делам изобретений и от 13035, Москва Ж, Раушская н Поддисета СССРытийаб., д. 4/5