Способ получения арахидоновой кислоты

Союз СоветскикСоциапистическикРеспублик ОЛ ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 897766по делам нэобретеннй н отрытнй(72) Авторы изобретения Московский ордена Трудового Красного 3 мени институт тонкой химической технологиии им, М В, Ломоносова(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРАХИДОНОВОЙКИСЛОТЫ Изобретение относится к усовершен ствованному способу получения арахи" доновой кислоты.Арахидоновая (цис, 8, 11, 14 эйкозатетраеновая) кислота входит в состав липидов клеточных мембран и является физиологически-активным веществом, кроме того она является предшественником простагландинов (ПГ), которые в последнее время на 10 ходят все более широкое применение в качестве эффективных лекарственных препаратов. В связи с перспективностью использования ПГ в самых различных областях медицины и ветеринарии15 необходимы доступные методы получения как самих ПГ, так и их предшественников, В настоящее время для получения ПГ, наряду с химическим синтезом, представляющим сложный и много 20 стадийный процесс, широко применяется их биосинтез из биологических предшественников с помощью ферментных препаратов простагландин-синтетазы,выделяемых из различных источников животного происхождения,Для успешного протекания процесса биосинтеза арахидоновая кислота не должна содержать примесей других кислот, а также изомеров с иным расположением двойных связей, которые активно ингибируют ферментативный процесс превращения субстракта в целевые соединения.Источником получения арахидоновой кислоты (АК) могут служить липиды различного происхождения, в которых наряду с остатками АК содержатся радикалы других жирных кислот, отличающихся как количеством углеродных атомов, так и числом и расположением двойных связей.Для получения АК из липидов известен ряд методов, основанных на различии физико-химических свойств липидов, таких как температуры плавпения и кипения, растворимость в различных растворителях, утойчивость35 40 45 50 55 комплексов с различными комплексо.образователями, стереохимические свойства молекул и другие характеристики.Для разделения жирных кислот широко используют различные их произвоДные, в частности бром- и ртуть-производные ненасыщенных жирных кислот 1, а также соединения включения с мочевиной или тиомочевиной 2. В последнее время для указанной цели все чаще применяют разнообразные хроматографические методы 31,Однако применение какого-либо одного из указанных методов не дает возможности выделить из смеси сложного состава индивидуальное вещество, в частности арахидоновую кислоту.Известен способ получения АК из липидов животного происхождения, включающий омыление липидов, фракционную низкотемпературную кристаллизацию полученной смеси жирных кислот, обработку концентрата ненасыщенных жирных кислот мочевиной и кристаллизацию мочевинных комплексов, разложение соединений включения кислот с мочевиной, этерификацию и фракционную перегонку в вакууме, омыление и фракционирование в вакуумеч 1.Совокупность выбранных приемов выделения и очистки не позволяет получить химически чистую АК, так как каж. дая из этих стадий основана лишь на незначительных различиях либо в растворимости, либо в стереохимии молекул, либо в температуре кипения.Для получения концентратов с достаточно высоким процентным содержанием АК приходится несколько раз повторять отдельные операции, что приводит к большим потерям целевого соединения. Кроме того, указанными методами не удается полностью отделиться от изомеров АК, которые делают ее непригодной для использования в качестве субстрата в биосинтезе проста. гландинов.Таким образом, к недостаткам данного метода следует отнести большую трудоемкость процесса, низкий выход (менее 303) и неудовлетворительное качество получаемой арахидоновой кислоты.Наиболее близким к предложенному является способ получения арахидоновой кислоты из липидов путем их омыЛения с использованием низкотемпературной кристаллизации при 0-(-5)ОС,5 1 о 15 го 25 зо извлечения из жидкой фазы неомыляемой части липидов экстракцией петролейным эфиром, Оставшуюся жидкую фазу подкисляют минеральной кислотой, из полученной реакционной массы экстрагируют жирные кислоты петролейным эфиром экстракт подвергают кристаллизации при (-28) - (-30)С, а затем при (-75) - (-78)д С, петролейный эфир отгоняют, полученную смесь кислот подвергают кристаллизации в ацетоне при (-77) - (-78) С с последуюощей его отгонкой.Полученный при этом концентрат арахидоновой кислоты этерифицируют метиловым спиртом и очищают хроматографией на силикагеле, импрегнированном нитратом серебра, в колонке с использованием в качестве элюента гексана и/или диэтилового эфира, причем последний берут в количестве 5 - 1001 от веса гексана, Из полученного концентрата метиловых эфиров выделяют арахидоновую кислоту путем испарения элюента с последующим щелочным гидролизом, экстракцией петролейным эфиром, подкислением полученной реакционной смеси минеральной кислотой и экстракцией арахидоновой кислоты петролейным эфиром 5 .Недостатком данного способа является сложность технологического процесса. Цель изобретения - упрощение процесса и повышение качества целевогопродукта,Поставленная цель достигается тем,что согласно способу получения арахидоновой кислоты из липидов путем ихомыления, низкотемпературной кристаллизации полученной при этом смесивысших жирных кислот, этерификацииалканолом, хроматографической очисткина колонке с селикагелем, импрегнированным азотнокислым серебром, щелочного гидролиза полученного эфираарахидоновой кислоты и выделения целевого продукта экстракцией петролейнымэфиром кристаллизацию смеси высшихжирных кислот осуществляют из диэтилового эфира при (-50) - (-25) С, полученную после этерификации смесь низших алкиловых эфиров жирных кислотподвергают фракционной вакуумной пере-.гонке при остаточном давлении 0,050,1 мм рт.ст. и последующую хроматографическую очистку соответствующегоэфира арахидоновой кислоты проводятс использованием в качестве элюентасистемы толуол-ацетон,Основу данного способа выделенияАК составляет хроматографическоеразделение на колонке с силикагелем,импрегнированным нитратом серебра.Для выделения на колонке в системетолуол-ацетон можно использовать сравнительно бедные смеси, содержащиетолько 20 АК. Поэтому в большинствеслучаев необходимо лишь небольшоеобогащение арахидоновой кислотой смеси жирных кислот, получаемой из исходного сырья, Обычно это обогащениедостигается уже после отделения насыщенных и части ненасыщенных кислотнизкотемпературной кристаллизациейи перегонкой смеси эфиров жирных кислот в вакууме, В случае же использования сырья, содержащего сравнительно большое количество АК (печеньмлекопитающих жир некоторых рыб ит,п. ), можно ограничиться лишь отделением насыщенных кислот низкотемпературной кристиллизацией их из раствора в подходящем растворителе. Химически чистую арахидоновую кислоту получают следующим образом,Иетиловый эфир АК, полученный после выделения на колонке, омыляют поизвестному методу водным растворомщелочи в спирте, Проведение указанногго процесса в атмосфере инертного газа и при низкой температуре (40-50 ). не вызывает каких-либо изменений вструктуре АК, что подтверждается различными методами (ПМР УФ- и ИК-спектроскопия, элементный анализ, кулонометрия и т,п,),П р и м е р 1 , Использованиеотходов производства инсулина,К 1000,0 г водной эмульсии липидов приливают 500 мл этилового спирта, добавляют 250,0 г ацетата калияи смесь перемешивают в токе азотапри 40 С в течение 1 ч, после чегорастворитель отгоняют в вакууме (1520 мм), Остаток после охлаждения до18 - 20 С подкисляют 2000,0 мл разнобавленной соляной кислоты (б д 1,03)и выделившуюся смесь жирных кислотизвлекают хлороформом (2 раза по500 мл), хлороформ упаривают в вакууме (15 - 20 мм), а остаток растворяют в 2000,0 мл серного эфира и подвергают низкотемпературной кристаллизации при (-30) - (-25)ф С в течение1,5 - 2 ч с последующим обратным фи 5 1 О 15 26 23 Э", 33 49 43 Ю И льтрованием, Осадок смешивают с 250 млсерного эфира и снова охлаждают при( 30) - (-25)о С в течение 15 ч. СмесьФильтруют, а объединенные маточныерастворы подвергают дальнейшей кристаллизации при -50" С в течение 1,5-2 ч,Выпавший осадок отделяют тем же способом, Фильтрат упаривают в вакууме(15 - 20 мм), а остаток растворяютв 250 мл метанола, добавляют 1 млхлористого ацетила и нагревают прикипении в течение 30 мин, после чегоотгоняют избыток метанола и образовав.шийся метилацетат. К остатку послеоохлаждения до 20 - 25 С добавляют200 мл петролейного эфира. Получен-ный раствор промывают насыщенным водным раствором хлористого натрия, после чего его пропускают чсрез слойсиликагеля ( 50 г, высота слоя 5 см ),сушат сернокислым натрием, растворитель удаляют в вакууме 15 - 20 мма остаток 51,0 г подвергают Фракционной перегонке при остаточном давлении 0,05 мм, Отбирают фракцию(9,2 г) с т.кип, 126 - 131 С (в парах), которую хроматографируют наколонке с силикагелем, импрегнированным нитратом серебра.Адсорбент готовят следующим образом,К смеси 150 г силикагеля Л 100/160меш и 15,0 г нитрата серебра добавляютпри интенсивном перемешивании 150 млдистиллированной воды. Полученнуюпастообразную массу сушат и затемРактивируют при 120 - 130 С в течениеч. Затем адсорбент охлаждают до20 - 25 С и добавляют 200 мл толуола при перемешивании, после чегосмесь переносят в хроматографическуюколонку длиной 800 и диаметром 35 мм.Смесь метиловых эфиров высших жирныхкислот (9,2 г), выделенных при фракционной перегонке, растворяют в 10 млтолуола и наносят на колонку обычным способом. В качестве элюентаиспользуют смесь толуол-ацетон (9:1).Отбирают фракции по 10 мл, состав которых определяют с помощью ТСХ напластинках с силикагелем, импрегнированным нитратом серебра, или с помощью метода ГЖХ. Фракции, содержащиехроматографически чистый метиловыйэфир АК, объединяют, растворительудаляют в вакууме (15 - 20 мл), аостаток растворяют в 25 мл петролейного эфира. Полученный раствор промывают последовательно водой (50 мл), 89776625 50 0,5 М раствором соляной кислоты(50 мл) и вновь водой (2 раза по50 мл), Эфирный раствор сушат сульфатом натрия, Фильтруют, растворитель удаляют в вакууме (15 - 20 мм) 5и получают 1,62 г химически чистогометилового эфира ЛК, чистоту которого проверяют методом ГИХ,Для приготовления арахидоновойкислоты полученный метиловый эфир ее 1 О(или этанола), добавляют ч мл 50 ного водного раствора КОН и смесьперемешивают в токе азота при чО"Св течение 15 мин. После охлаждения 15до 25 - 30 С к смеси при перемешивании в токе азота добавляют 50 мл разробавленной соляной кислоты (д,1 1,05)и АК экстрагируют петролейным эфиром(3 раза по 50 мл). Объединенные эфирные экстракты сушат сульфатом натрия,фильтруют, растворитель удаляют ввакууме (10 - 15 мм), а остаток досушивают при остаточном давлении0,05 - 0,06 мм рт.ст. в течение30 мин, Получают 1,ч 8 г арахидоновойкислоты в виде прозрачного желтоватого масла с выходом 12,23, считаяна исходные липиды.Показатель преломления полученногообразца АК составляет и1,4915 (по2 олитературным данным п 2 о 1,1901), иодное число 333,50 (среднее по результатам трех измерений), что совпадаетс расчетным.Число двойных связей в расчете наодну молекулу полученной АК по данным кулонометрического титрования(среднее по результатам трех измерений) и по значению иодного числа,о.40По данным УФ- и ПМР-спектров полученный продукт представляет собой химически чистую арахидоновую кислоту,По данным ГЖХ в стандартных условиях метипового эфира АК, приготовлен. 45ного обработкой 5 мг АК диазометаномв эфирном растворе содержание примесей в целевом продукте составляетменее 0,13 (в кацестве внутреннегостандарта использовали метиловыйэфир линолевой кислоты).Аналогичные результаты были получены при использовании на стадии омыления метилового, пропилового и изопропилового спирта. 55П р и м е р 2 . Использованиеотходов производства препарата "Арахиден". К 63,ч отходов, представляющихсмесь этиловых эфиров высших жирныхкислот и содержащих по данным ГНХ3,24 этилового эфира АК, приливают70 мл этилового спирта и раствор10 г КОН в 20 мл воды, Смесь перемешивают в токе азота при 80 С в течеоние 1 ч, затем отгоняют 50 мл спирта,а к остатку после охлаждения до 2.30 С при перемешивании добавляют100 мл разбавленной соляной кислоты(д 1,05) и извлекают смесь жирныхкислот петролейным эфиром (2 раза по100 мл), Объединенные экстракты промывают водой (2 раза по 150 мл),после чего сушат сульфатом натрия.Петролейный эфир удаляют в вакууме(10 - 15 им), к остатку добавляют300 мл серного эфира и полученнуюсмесь подвергают кристаллизации при(-55) - (-50) С в течение 2 ц. Вы,павший осадок отделяют обратным фильтрованием, От маточного раствораотгоняют растворитель в вакууме(10 - 15 мм), а остаток нагреваютпри кипении со 100 мл метанола втоке азота в присутствии 1 мл хлористого ацетила в течение 2 ч. Реакционную массу затем обрабатывают пометодике, приведенной в примере 1.После фракционной перегонки в вакууме (0,05 - 0,06 мм) выделяют фракцию с т. кип, 126 - 131 С (в парах),из которой получают 1,02 г химическичистой АК с помощью хроматографиина колонке с силикагелем, импрегнированным нитратом серебра, и последующим омылением метилового эфира вусловиях, описанных в примере 1,Выход арахидоновой кислоты составляет 50/, считая на исходную смесьэтиловых эфиров высших жирных кислот.Чистоту полученного образца АКдоказывают методами, указанными впримере 1.Характеристики продукта идентичныполученным в примере 1.Аналогичные результаты были получены при использовании на стадии омыления метилового, пропилового и изопропилового спиртов,Применение предложенного способаполучения АК позволяет испольэоватьбольшое количество липидных отходовпроизводства эндокринных препаратов.Формула изобретенияСпособ получения арахидоновой кислоты из липидов путем их омыления,897766 толуол-ацетон,Составитель Н. ТокареваРедактор Л. Веселовская Техред А, Ач Корректор М. Шароши Заказ 11860/32 Тираж 447 ВНИИПИ государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5Подпи сное еФилиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул; Проектная,низкотемпературной кристаллизац иполученной при этом смеси высшихжирных кислот, этерификации алканолом, использования хроматографической очистки на колонке с силикагелем,импрегнированным азотнокислым серебом, щелочного гидролиза полученногоэфира арахидоновой кислоты и выделения целевого продукта экстракциейпетролейным эфиром, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса и повышения качествацелевого продукта, кристаллизациюсмеси высших жирных кислот осуществляют из диэтилового эфира при(-50) - (-25) С, полученную послеэтирификации смесь низших алкиповыхэфиров жирных кислот подвергаютфракционной вакуумной перегонке приостаточном давлении 0,05-0,1 мм рт.ст.и последующую хроматографическую очистку соответствующего эфира арахидоновой кислоты проводят с использованием в качестве элюента системы 5Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Хроматография в тонких слоях.Под ред. Э, Шталя. М "Мир", 1970,со с. 236 - 243,2. Физер Л физер М. Реагентыдля органического синтеза, т. 2,М., "Мир", 1970, с. 316 - 321.3. Кейтс М. Техника липидологии,ь М., "Мир"., 1975 с. 128 - 136.Авторское свидетельство СССРпо заявке М 2339452/2304,кл. С 07 С 57/02, 1976.5, Авторское свидетельство СССРпо заявке й 2403863,кл. С 07 С 57/02, 1976 (прототип).