Способ определения активности глютатион-пероксидазы в биологических тканях

Союз СоветсиииСоциапистичесиииРеспублик ОП ИСАНИ Е ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ пи 922 б 37(51) М. Кл. з 01 й 33/48 Государственный комитет ло делам изооретеннй и открытий(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГЛЮТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХИзобретение относится к медицине а именно к биохимии, при изучении липидного обмена в тканях экспериментальных животных и человека.Известен способ определения активности глютатион-пероксидазы в биологических тканях путем инкубации гомогената ткани с гидроперекисью трет-бутила в качестве субстрата с последующим центрифугированием и спектрофотометрией супернатанта 11.Однако известный способ не обеспечивает необходимой чувствительности из-за недостаточной специфичности и сложности известного способа.Цель изобретения - повышение. чувст 15 вительности способа.Эта цель достигается тем, что, согласно способу определения актив-. ности глютатион-пероксидазы в биологи 20 ческих тканях путем инкубации гомогената ткани с гидроперекисью трет-бутила в качестве субстрата с последующим центрифугированием и спектрофотометрией супернатанта, перед добавлением к исследуемой смеси субстрата инкубационную смесь выдерживают в те" чение 50-60 мин, а определение актив. ности глютатион-пероксидазы ведут на спектрофотометре при длине волны 262 нм.Способ осуществляют следующим образом,После забора биологические ткани хранят и гомогенизируют в 0,05 М Фосфатном буфере в соотношении 1:50. Инкубационная смесь включает 0,3 Мфосфатный буфер рН 7,4 - 1,2 мл;0,05 М ЭДТЛ - 0,2 мл, 0,01 М глютатион восстановленный - 0,3 мл; гомогенат 0,2 мл, Предварительную инкубацию проводят в течение 50-60 мин прид37 С. Реакцию запускают добавлением 0,1 мл гидроперекиси трет-бутила 0,002 М, через 1-2 мин реакцию оста-. навливают 103-ным раствором трихлоруксусной кислоты в количестве 1 мл на пробу. В контрольную пробу гидро3 9226 перекись трет-бутила не добавляют. Пробы центрифугируют в ечение 15- 20 мин при 1500 - 2000 об/мин, после чего отбирают по 2,5 мл центрифугата и определяют экстинкцию по разнице экстинкций между опытными и контрольными пробами при 265 нм.П р и м е р 1, Околоушную железу гомогенизируют на,холоду в 0,3 М фос- . фатном буфере в соотношении 1:50. , 10 Затем проводят преинкубацию при 37 С в течение 50 мин в инкубационной смеси следующего состава: 0,3 М Фосфатный буфер рН 7,4 - 1,2 мл; 0,005 М ЭДТА - 0,2 мл 0,01 М глютатион вос-. 5 ,становленный - 0,3 мл; гомогенат0,2 мл. Общий обьем пробы 1,9 мл. Реакцию запускают добавлением субстрата - 0,002 М гйдроперекиси третбутила - 0,1 мл, Через 1 мин реакцию 20 останавливают 103-ным раствором трихлоруксусной кислоты в количестве 1 мл. Контрольная проба содержит 0 3 И Фосфатйый буфер рН 7,4-1,2 мл . 0,005 М ЗДТА - 0,2 мл; 0,01 М глюта. 25 тион восстановленный - 0,3 мл;гомогенат.0,2 мл;10-ная трихлоруксусная кислота мл. Все пробы центрифугируют и оп-. ределяют активность. фермента по разнице экстинкций на спектрофотометре зО при 262 нм. Выражают активность фер. мента в микромолях на грамм ткани в минуту и рассчитывают по Формулеае х 3А -0,20,02г гдеЗ разница экстинкций между контрольной и опытной пробами; 3 - объем кюветы; а -экстинкция 0,3 мл 0,01 М окисленного глютатиона,: й - время ин.кубации, мин. Так активность фермента в околоушной железе в среднем составляет 806. микромолей на граммткани в минуту.П р и м е р 2. Десну и альвеолярный отросток гомогенизируют на холоду в 0,3. М Фосфатном буфере в соотношении 1:50. Затем проводят преинкубацию при 37 С в течение 60 мин в инкубационной смеси (состав смеси тот же, что и в примере 1). Реакцию запускают добавлением субстрата,002 И гидроперекиси трет-бутила.0,1 мл. Останавливают реакцию через, 2 мин 10 ь-ным раствором трихлоруксусной кислоты в количестве 1 мл. Остальное, как в примере 1. Активность глютатион-пероксидазы в этих тканях 198 и 180 микромолей на грамм тканив минуту соответственно.Таким образом, предложенный способ позволяет повысить чувствительность методики определения активности глютатион-пероксидазы и ее специФичность, ускорить проведение исследования, повысить точность и определить активность фермента во всех тканях.Формула изобретенияСпособ определения активностиглютатион-пероксидазы в биЬлогических тканях путем инкубации гомогената ткани с гидроперекисью трет-бутилав качестве субстрата с последующимцентрифугированием и спектрофотомеррией супернатанта, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышениячувствительности способа, перед добавлением к исследуемой смеси субстрата инкубационную смесь выдерживаютв течение 50-60 мин, а определениеактивности глютатион-пероксидазы ведут на спектрофотометре при длиневолны 262 нм,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Ланкин В. 3 Гуревич С, И.,Котельцева Н. В Тихадзе А. К. иГерасимова Е. Н. Роль перекисей липидов в патогенезе атеросклероза"Вопросы медицинской химии", 1976Ю 22, 3, с. 392-395Составитель 9. АлмазовРевактор А. Козориз Техоед Т.Иаточка Кооректор О. БипакЗаказ 2573/59 Тираж 883 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий11 ОД Москва ЖРаушская наб. д, 4/Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная,