Способ получения негамицина

(32 05.69 иоритет827/69убликованоЗ Государственный комитет Совета 1 йиннстроа СССР оо делам изооретеннй н открытий) УЙК 615.45 с т 615.779.931 (088.8) . ень З 2 24,07. 78 45) йата опубликова исани остранцыендэи Маеда, Синичи Кондо, ТомМаса ХамадаЯпония) Хамао Умеэа(72) Авторы изобретения акеу в Кагаку Кенкю Кай Ин эайдан Ходэтранная фин Бисейбут(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕГАМИЦ Изобретение оантибиотиков.Предлагаемыймицина ранее в ической литературся в том, что шт носится к проспособ получетентной и науие описан имм Я 81 йоттт водству аэветалей ния негачно техни- заключаетсев цел ричнеом от ричн име 1 зеОЬЬСОЬ АТСС 21470 выращивают в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азо О та и минеральные соли, с последующим выделением . антибиотика.Штамм бЬефоптсее рц рео Басов АТСС 21470 выделен иэ образца почвы, 1 а собранного в Миогизане, префектура Гунма, хранится в Американской коллекции типовых культур под номером АТСС 21470 и характеризуется следующими культурально-морфологическими и фиэиоло- рО го-биохимическими свойствами.Культурально-морфологические признаки, Штамм образует хорошораэветвленный субстратный мицелий под прямым направлением к гибкому аэриальному мицелию без 2 б ения завитков и образования с р . Поверхность спор гладкая,Глицерин Чапека с агаром. При инкуобации при 27 С культура цветом от светло-желтого до темно-желтовато-коричневого образует обильный мицелий светло/серого цвета, растворимый пигмент цветомот коричневого до бледно-красновато-кориневого.Среда Краинского с глюкозой, вспврагином и агаром. Культура от ж товатокоричневого до темно-желтовато-кового цвета, образует мицелий цветжелтовато-белого до светло-ко еватосер огорастворимый пигмент ет слабый коричневый цвет.Среда с малевтом кальция и агаром.Культура серовато-коричневого цвета образует скудный мнцелий цветом от серовато-белого до светло-серого, растворимый пигмент не образует,Пептоновый раствор, содержащий 1,0%нитрата натрия, Культура от бесцветнойдо светло-желтовато-коричневого цветабез аэриального мицелия, растворимыйпигмент отсутствует или наблюдаетсянебольшое количество коричневого пигмента; слабое восстановление нитрата.Картофельная среда. Морщинистая культура цветом от светло-желтовато-коричненого до желтовато-коричневого, позднеедо темно-желтовато-коричневого и до чер.ного, отсутствует аэривльный мицелий,растворимый пигмент слабо-коричневогоцвета. оПластинка иэ крахмала с агаром. Культура цветом от светло-желтовато-коричневого до желтовато-коричневого, образуетаэриапьный мицелий цветом от желтоватобелого до светло-серого, растворимыйпигмент цветом от коричневатого до светло-красновато-коричневого.Питательная среда с вгаром, Послеинкубации при 37 С в течение 14-ти суток роста культуры не наблюдается, Посоле инкубации при 27 С культура светлокрасновато-коричневого цвета, не образует аэриальногомицелия и образуетсветло-красновато-коричневатый растворимыйпигмент. 25Среда Лоффпера с коагулированной сыовороткой. После инкубации при 37 С втечение 14-ти суток роста культуры ненаблюдается.Желатиновая среда. После инкубации ЗОопри 20 С культура от бесцветной до свечц.по-желтовато-коричневой, не образуетаэривльного мицелия и образует растворимый пигмент цветом от коричневого дбтемно-коричневого. 35оСнятое молоко. После инкубации при37 С бесцветная культура не образуетаариального мицепия или растворимого пигмента.Среда с тирозином и агаром, После 40оинкубвции при 27 С культура от бесцвет-ной до серого или темно-коричневого цвета, образует тонкий аэривльный мицелийцветом от белого др серовато-белого.Физиолого-биохимические признакиАароб. Оптимум роста при 27 С,Гидролизует крахмал,Разжижает жепатину,Пептониэирует молоко.50Отношение к углеводам. Усваивает глюкозу, свхароэу, мапьтозу, маннозу, галактозу, глицерин, декстрин, крахмал.Не усваивает фруктозу, ксилоэу, инозит, дактозу, раффинозу, рамнозу, инсулин, 55 сорбит, врабинозу, сапицин, дульцит.Антагонистические свойства, Ингибирует ростРбЕ ц ЗОщоиаб,ба 3 птоИе Иа,ЙеЪвеИа,Ыар 1 у 1 ососсцв, Ро 1 еце. Конкретные примеры осуществления предлагаемого способа приведены ниже,П р и м е р 1, 125 мл среды состава,%;Глюк рэа 2,0000 Крахмал 2,0000 Соевая мука 2,0000 Экстракт дрожжей 0,5000 Хлористый натрий 0,2500 Карбонат кальция0,3500 Пентагидрат сульфата меди 0,0005 Гептвгидрат хлористогомарганца 0,0005 Гептвгидрат сульфата цинка 0,0005 помещают в колбу емкостью 500 мл. Устанавливают рН 7,0 и стерилиэуют смесьопри 120 С в течение 20 мин. Затем в асептических условиях к атой среде прибавпяют 2,5 мл 2-дневного бульона штамма АТСС 21470,Среда дпя затравочной культуры содержит, %;Глюкоза 1,0000Крахмал 1,0000Мясной экстракт 0,7500Пептон . 0,7500Хлористый натрий 0,3000Гептагидрат сульфатамагния 0,1000Пентвгидрат сульфата меди 0,0007Гептагидрат сульфата двухвалентного железа 0,0001Гептвгидрат хлорида марганца 0,0008Гептвгидрат сульфата цинка 0 0002,Сбраживание ведут 5 суток при 27 С ипри встряхивании со скоростью 130 коле.баннй в минуту Этот бульон центрифуги-.руют для отделения мицелия, и 600 млфильтрата получают из шестидесяти склянок. Фильтрат содержит35 мкгlмл негамицина, фильтрат пропускают через колонку (диаметр 30 см) с 400 мл амберлита 1 КС(70%-ная натриевая форма),После промывания водой негамицин алюируют 20%-ным водным аммиаком, Актив-.ную фракцию обьемом 600 мп концентрируют при пониженном давлении и получают 144 мл концентрированного раствора(рН 9,4 800 мкг/мл).Концентрированный раствор пропускают через колонку (диаметр 16 мм) с 60 мл смолы Дауэкс 1 Х 2 в гидроксильной форме. После промывания 200 мл воды негамицин алюируют 0,5 н. раство. ром НСм. После нейтрализации амберлифтом 1 Р(в гидроксильной форме) ак тивную фракцию высушивают при понижен ном давлении. Порошок-сырец гидрохлори622414 дв негамицина весом 300 мг имеет 21%ную чистоту,Порошок-сырец (300 мг) гидрохлорида негамицина растворяют в 10 мл воды,раствор пропускают через колонку (диаметр 16 мм) с 60 мл амберлитв СЯ 50 (в аммониевой форме) и промываютдистиллированной водой. Вытекающий раствор отбираютфракциями объемом по 10 мл.Активное вещество находится во фракциях 57-96. Иэ фракции 57-84 получают25 мг (чистота 68 мкг/мг) светло-желтоватого порошка негамицина, иэ фракции75-85 - 20 мг бесцветного порошка чистого негамицина, из фракций 86-96 -19 мг негамицина (чистота 910 мкг/мл),15П р и м е р 2. 130 л среды состава,%:Глюкоза 3,000Крахмал 1,0000Соевая мука 2,0000 гоСухие дрожжи 0,5000Карбонат кальция 0,3500Пентагидрат сульфата меди 0,0005Тептагидрат хлорида мар,0005ганца г 5Гептвгидрат сульфате цинка 0,0005 помешают в изготовленный из нержавеющей стали аппарат для ферментации емкостью 200 мл, стерилизуют 30 мин призо 120 С, инокулируют в асептических условиях 1,2 л культурированного бульона штамма АТСС 21470, перемешивают со скоростью 200 об/мин ивэрируют 25 л воздуха в 1 мин в течение всего периода ферментации - 113 ч. Температуру35о.поддерживают 27 С. рН 110 л бульона СН, - СН - Сй, - Сн- Сн- С -ян - м - Сн, - Соон1йюй ОН мЧ О Сн Амфотерен, обладает .еильноосновнымии слабокислотными свойствами. Негвмицин ингибирует рост грамотрицательных и грамположительных органиэ О мов. При определении бактерицидного эффекта с использованием вгара с мяснымэкстрактом и пептоном (чайную ложку культуры, выросшей за 20 ч в питателыойсреде, размазывают в виде полоски) ин гибируются следующие организмы при следующих концентрациях (величины в скобках показывают концентрации при частичном ингибировании), мкг/мл: о 1+ 2,5 (с 2,Н О)Максимума поглощения в Уф-спектрев нределвх 220-400 ммк не имеет,Максимальные частоты поглощения вИК-спектре, (КВч):,3430, 3200, 3(50,2950, 1660, 1590, 1405, 1320, 1140,1050, 970, 890, 820, 720 смБелый порошок, хорошо растворимвводе, не растворим в метаноле, этаноле,эфирах, бензоле,Дает положительную реакцию на нингидрин, реактив Гидона-.Смита и отрицательную реакцию нв внтрон и реактив Свквгучи.(рН 7,4, 63 мкг/мл) устанавливают 4,9 при помощи 1 л 6 н, НС 3, а затем профильтровывают через 8 кг диатомовой земли, Включая воду, использованную для промывания фильтра, получают в обшей сложности 117 л фильтрата, который пропускают через колонку с 6,5 л амберлита 1 КС(70%-ная аммонийная форма), После промывания водой негамицин элюируют 0,5 н. раствором аммиака, активный элюат объемом 3 л концентрируют до 495 мл (3520 мктУьи) при пониженном давлении; Концентрат пропускают через колонку с Двуэксом 1 Х 2 (гидроксильная форма)промывают 350 мл воды и элюируют негамицин 0,5 н, НС 3 . 180 мл активного элюата нейтрализуют 3 н, аммиаком, сушат и получают 5,5 г желтовато- коричневого порошка негамицина-сырца (чистота 294 мкг/мг). Общий выход 23,4%.3,4 г порошка негамицина 29;4%-ной чистоты растворяют в 22 мл воды, устанавливают рН 8,8 и вводят раствор в колонку (диаметр 26 мм), заполненную смолой амберлит ССв аммонийной форме. После промывания 500 мл воды через колонку пропускают 0,1%-ный амми- ак, элюат отбирают фракциями по 20 мл, Негамицин обнаруживают во фракциях 69 -81. Иэ фракций 69-73 получают 233 мг (90%-ная чистота) светло-желтоватого порошка негвмициьа, из фракций 74-77 получают 383 мг чистого негамицина, иэ фракций 78-81 - 395 мг.Антиби отик негамицин, обладающий антибактериальной активностью, имеетструктурную формулу10 622414 Рв.ае нова Ю 3Рв.аецф нова ИдФЬ 3,12 (1,56) 50,00 Составитель Н. БондаренкоРедактор Н, Хубларова ТехредН. Бабурка КорректорМ. немчик. Заказ 4720 Тираж 568 Подписное ЦНИИ 11 И Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская набд, 4/5филиал ППП Патент, г, Ужгород,: ул. Проектная, 4 М.вефеа 6 в ЬОтНегамицин не ингибирует альбикановпри концентрации 100 мкгlмл, ингибирующий эффект его не снижается в присутствии сыворотки; например,Е. Соб ингиби"руетоя при помощи 3,12 мкг/мл негамици 1 Она во всех средах, содержащих сывороткув концентрации 0,5, 10, 20, 40%.Яегамицин оказывает более сильноебактерицидное влияние при щелочных ве. личинах рН, Например, ингибирующаяконцентрация против Е.СОВ в 0,5%-номпептоне в воде,при различных величинахрН следующая (в скобках даны концентрации для частичного ингибирования), мкг/млрН 5 0;12 5 (3,12)рН 60-12 е 5 (Зэ 12)рН 7,0-3,12 (1,56); рН 8,0-1,56 (0,78);рН 9,0-1,56 (0,78).При методе с цилиндрической пластинкой с использованием 0,5%-ного пептонового агара и Е.со 2 К 12 концентра 25ция негамицина в 25 мкг/мл дает следующие диаметры ингибированных участковпри следующих величинах рН: 6,0-16 мм,7,0-20 мм,. 8,0-21 мм,Негамицин обладает низкой токсично 30стью. При внутривенном впрыскивании. доэы в 400 мг/кг мышь погибает, Токсичных признаков не обнаруживается при ежедневном интраперитониальном введении 200 мг/кг мыши в течение 30-ти дней, Задержанной токсичности также не набгиодаетсяПри внутримышечном введении 50 мг/кг кроликам обнаруживается высокая концентрация в крови - 100 мкг/млчерез 1 ч после введения и 80% выводится с мочей эа 24 ч, что показывает высокую концентрацию препарата в моче например, 4480 мкг/мл в моче, взятой через 1-2 ч после инъекции. формула изобретении Способ получения негамицина, о т - личающийся тем,чтоштамм Мер 1 омусее ри рео 1 ивсце АТСС 21470 выращивают в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта.