Способ обнаружения клофелина в биологических жидкостях

(1 0" АНИЕ ИЗОБРЕТ ИЯ МУ СВИДЕТ А Т макокинетиче ческих лабор чувствительно ние токсичнос мочи подверга с последующе раммы реакти родной кис обнаружением реза, Использ ет повысить примерно в 3 клофелин в пр ных веществ с(21) 47729 (22) 28.11 (46) 07,07 (71) Тюме ский инст (72) Б.Н.Б (53) 616.0 (56) Суд. М 4,с. 36- КЛОФЕЛИСТЯХ при токсиских и фарником или 30 мин на глицериновой бане (140 + 5 ОС), После охлаждения гидролизат а центрифугируют при 5000 об/мин 5 мин и надосадочную жидкость сливают в колбу.Осадок трижды промывают 10 мл раствора а хлороводородной кислоты (5 мл конц. уд.вес, 1 19+ 95 мл воды) с последующим цен- д трифугированием. Надосадочные жидкости объединяют, .подщелачивают до рН 9-10 25-ным раствором гидроксида аммония и экстрагируют хлороформом (25 мл х 3) в течение 20 мин. Образующуюся эмуль сию разрушают центрифугированием при 5000 об/мин. Экстракты отделяют, хлороформ испаряют при комнатной температуре до остаточного объема 2 мл.На полоску хроматографической бумаги марки М (15 х 29 см) наносят по 0,02 мл растворов экстрактов модели крови, контроля крови (извлечение соэкстрактивных веществ проводят из 10 мл крови по описанной методике), раствора "свидетеля" содержащего 10 мкг клофелина. Диаметр ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР 63/148992, Бюл. %25нский государственный медицинитутекетов и Г;А.Лисионкова 7 (088,8)мед, экспертиза, 1983,38.54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКО57) Использование: в медицинекологических, биофармацевтиче Изобретение относится к области меди-цины, а именно к способам обнаружения клофелина (гемитона, катапресана, клони- дина), и может быть использовано при ток- сикологических, биофармацевтических и фармакокинематических исследованиях в условиях клинических лабораторий.Целью изобретения является повышение чувствительности, селективности и снижения токсичности способа обнаружения клофелина в биологических жидкостях (кровь, моча).П р и м е р 1. Исследование крови (модельный опыт),10 мл крови, содержащей 1000 мкг . клофелина, после инкубирования в течение 24 ч при комнатной температуре смешивают с 25 мл воды и оставляют для гемолиза на 20 мин, После добавления по каплям при перемешивании 9 мл 20 О-ного раствора трйхлоруксусной кислоты раствор нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 ч в колбе с обратным холодильских исследованиях в клиниаториях, Цель - повышение сти, специфичности и снижети способа, Пробукрови или ют электрофорезу на бумаге й обработкой электрофорегвом и. раствором хлороводолоты с рН 20 25 и клофелина по длине пути фоование изобретения позволя- чувствительность .реакции -4 раза и идентифицировать исутствии других лекарственопутствующей терапии, 1746314начального пятна 0,3-0,5 см, расстояниемежду точками нанесения 2 см. Электрофорез проводят в течение 1 ч при напряжении400 В, в модифицированных камерах к прибору ПЭФ. Начальная температура электролита 20 С.Электролит - , универсальный буферныйраствор Бриттона-Робинсона рН 1,8, Элекгрофореграммы (Э Ф Г) высушивают на воздухе и обрабатывают последовательно 10модифицированным реактивом Драгендорфа по Бертгоффу-Дельвиче и раствором хлороводородной кислоты с рН 2,0 - 2,5.Обнаружение окрашенных в темно-серыйцвет зон клофелина на светло-сером фоне 15проводят по длине пути фореза (ДПФсм) -расстояние от линии старта до переднегокрая зоны, в сравнении с ДПФсм "свидетеля". Чувствительность реакции обнаружения клофелина 0,3 - 0,5 м г в. пробе. При 20обработке ЭФ Г по данной етодике обнаруженные зоны клофелина содержащие 10мкг и более, имеют темно-серый цвет с красноватым оттенком, интенсивность которогозависит от концентрации препарата. Предел обнаружения составляет 50 мкг клофелина на 10 мл объекта.П р и м е р 2. Исследование мочи (модельный опыт),199 мл мочи, содержащей 1000 мкг клофелина, после 24 ч инкубирования при комнатной температуре подкисляют до рН 1,0концентрированной хлороводородной кис.лотой и нагревают на кипящей водяной банев течение 1 ч в колбе с обратным холодильником или 30 мин на глицериновой бане .(140-5 С). После охлаждения гидролизат.подщелачивают до рН 9 - 10 25%-ным раствором гидроксида аммония и экстрагируютхлороформом (40 мл х 3) в течение 20 мин. 40Образующуюся эмульсию разрушают центрифугированием при 5000 об/мин 5 мин,Экстракты отделяют, хлороформ испаряютпри комнатной температуре до остаточногообьема 2 мл. Очистку хлороформного экстракта мочи и обнаружение зон клофелинапроводят электрофорезом на бумаге по методике, описанной в примере 1, Для нанесения на ЭФГ используют по 0.02 млрастворов модели мочи, контроля мочи (извлечение соэкстрактивных веществ проводят из 100 мл мочи по описанной методике),раствора "свидетеля", содержащего 10 мкгклофелина, Предел обнаружения составляет 50 мкг клофелина на 100 мл объекта, 55П р и м е р 3. Исследование мочи (клинический материал).100 мл мочи больного Н, принимавшегов течение 18 сут клофелин в терапевтических дозах(0,075 мг х 3) в сочетании с коринфаром, феназепамом, анаприлином, циннаризином, подкисляют до рН 1,0 концентрированной хлороводородной кислотой и нагревают на глицериновой бане (140+ 5 С) в колбе с.обратным холодильником. После охлаждения гидролизат подщелачивают до рН 9-10 25%-ным раствором, гидроксида аммония и экстрагируют хлороформом в течение 20 мин (10 мл х 3), Образующуюся эмульсию разрушают центрифугированием при 5000 об/мин 5 мин. Экстракты отделяют, хлороформ испаряют при комнатной температуре до остаточного объема 2 мл, Параллельно по данной методике были получены экстракты из мочи: модельный опыт (1000 мкг клофелина в 100 мл мочи, контрольный опыт 100 мл мочи больного Н до приема клофелина.На линию старта полосы хроматографической бумаги марки М (15 х 29 см) наносят в три отдельные точки по 0,05 мл растворов экстрактов: модели мочи, контроля мочи и мочи больного В четвертую точку наносят "свидетель" - клофелин, в пятую: клофелин и смесь веществ, сопутствующей терапии (коринфар, феназепам, анаприлин, циннаризин). Диаметр начального пятна 0,3-0,5 см, расстояние от края ЭФГ не менее 1,5 см, расстояние мйкду точками нанесения 2 см. Электрофорез проводят при избранных условиях (пример 1) ЭФГ высушивают на воздухе. В УФ-свете отмечают локализацйю зон веществ, обладающих свечением, По характеру свечения (коринфар желто-зеленого, феназепам желтое, анаприлин фиолетовое. циннаризин светло-фиолетовое) и ДПФ проводят идентификацию этих веществ. При значении рН электролита 1,8 клофелин в УФ-свете не флюресцирует. После обработки модифицированным реактивом Драгендорфа по Бертгоффу-Дельвиче тотчас обрабатывают раствором хлороводородной кислоты с рН 2,0-2,5 до.перехода оранжевого окрашивания фона в светло-серое, зона клофелина при этом окрашивается в темносерый цвет,Идентификацию окрашенных зон исследуемых веществ проводят по ДПФсм. Характер окрашивания и ДПФсм клофелина - "свидетеля" и клофелина, выделенного из мочи больного, идентичны и равна 9,7 см.При исследовании клинического материала (моча) было установлено, что обнаружению и идентификации клофелина не мешают также вещества, назначаемые совместно с ним: триампур, агапурин, фентоламина гидрохлорид, курантил.Изучено влияние рН раствора хлороводородной кислоты на характер окрашива174 б 314 Составитель В.МитюшинТехред М.Моргентал.Корректор Н.КорольРедактор Н.Бобкова Заказ 2392 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 ния зоны и фона. Установлено, что при значении рН от 2,0 до 2,5 данная реакция обнаружения обладает максимальной чувствительностью.Обнаружение клофелина при данной 5 чувствительности возможно при использо. вании хлороводородной, азотной и серной кислот и невозможно в присутствии фосфорной и уксусной. Выбор в качестве детектирующего реагента хлороводородной 10 кислоты обусловлен ее доступностью и меньшей токсичностью.Таким образом, предлагаемый способ обнаружения клофелина в биологических жидкостях высокочувствителен, нетокси чен, селективен, так как позволяет дифференцировать препарат в присутствии лекарственных веществ сопутствующей терапии, Кроме того, предлагаемый спо. соб позволяет повысить чувствительность 20 реакции по сравнению с известным способом (в известном чувствительность реакции 10 - 15 мкг, в предлагаемом 0,3 - 0,4 мкг в пробе),Формула изобретения Способ обнаружения клофелина в биологических жидкостях путем изолирования подкисленной водой, проведения гидролиза, экстракцию органическим растворителем с последующим разделением компонентов пробы и обнаружением кло-,ф фелина после обработки реактивом Дра-гендорфа по Бертгоффу-Дельвиче, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности, специфичности и снижения токсичности способа, разделение компонентов пробы. проводят электрофорезом на бумаге с последующей обработкой электрофорограммы реактивом и раствором хлороводородной кислоты с рН 2,0-2,5 и обнаружением клофелина по длине пути фореза.