Способ получения антибиотика

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 12.11,65 (21) 1037618/13 51) М.Кл. С 12 Р 9/00 2 3) Приорите Гасударственный камитетСаеета Министраа СССРпа делам изабретений.и аткрьпий 3) -(31 Опубликовано 30.04.77. БюллетеньДата опублиювания описания 14.11.77 53) УДК 615.7772) Авторы изобретения ИностранцыЛеон Нине и Жа(Фракция) Д ено Заявитель Ро ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА(54) СП Субстратный мицелий коричнево-желтый досветлого, Воздушный мицелий отсутствует.Растворимый пигмент коричнево-желтый,светлый.Агар-агар Эмерсона. Развивается хорошо.Субстратный мицелий коричнево-желтый досветлого. Воздушный мицелий отсутствует,Растворимый пигмент от,коричневого до желтого светлого.Агар-агар триптоновый. Субстратный мицелий коричнево-желтый, хорошо развит;воздушный,мицелий аветло-сероватый; растворимый пипмент коричнево-желтый, темный.Агар-агар глюкозо-пентоновый. Субстратный мицелий хорошо развит, коричнево-желтый, местами черноватый; воздушный мицелий отсутствует; растворимый пигмент ко.ричнево-желтый, сероватый.Питательный агар-агар. Степень развитияслабая. Обратная сторона колоний сероватожелтая, развитие слабое; воздушный мицелийи растворимый пигмент отсутствуют.Глюкозо-аспарагиновый агар-агар. Обратная сторона колоний коричнево-желтая, воздушный мицелий оветло-розовато-серый, растворимый пигмент светлый коричнево-желтый,Глицерино-аспарагиновый агар-агар. Субстратный мицелий от светло-желто-коричневого до светло-коричнево-желтого; воздушный грунта графст ры илкндричеокие с(0,8 - 1,2) мим.Беннетта. Разви 1Изобретение относится к области медицины, в частности к производству антибиотиков.Предлагается способ получения нового антибиотика 8,036 К.Р., где в качестве грибапродуцента используют штамм Яер 1 оптусезсапайепз 1 з ККРМ 3155.Штамм зарегистрирован в Северной областной исследовательской лаборатории в Преории, Иллинойс, США под номером й 1 КК 1.3155.Этот организм выделен из образцавзятого в Канаде в провинции Кввбеква Водрей, в Сент Марте,Основные характерные признаки штаммаЯгер 1 огпусез сапайепз 1 з МКК 1. 3155,Спороносные волокна нрямые, ровные,описывающие лепкие колебательные,движения лишь случайно и только на некоторойчасти длины волокна или у его конца. Оченьдлинные, обычно превышают 100 м.51 г. сапайепз 1 з представляет собой аппар ат спор ообр азующих воздушных ортановрозовато-серого цвета, Его характерная ок,раска,ясно ви%на в некоторых крахмальныхсредах, где опорообразование протекает хорошо и может быть еще улучшено присутствием земли.Образует ц по размером3мицелий светло-серый, слегка розоватый, умеренно развитый.Агар-агар с малеатом кальция (Краинского). Развитие очень умеренное, обратная сторона, колоний от серовато-белого до желтовато-белого, воздушный мицелий и растворимыйпигмент отсутствуют.Агар-агадир с тирозином. Степень, развитияслабая. Субстратный мицелий от бесцветногодо светло-серо-коричневого. Растворимый пнтмент, коричневатый, светлый, малоинтенсивный.Агар-агар с крахмалом. Развитие культуры очнь умеренное. Субстратный мицелий отсероватобелого до желтовато-белого. Воздушный мицелий светлый, сероватый, умеренно развитый, Растворимый пигмент сероватокоричнево-желтый.Агар-агар с крахмалом Гранди, Обратнаясторона колоний коричнево-желтая, светлая;воздушный мицелий,светлыйрозовато. серый;растворимый пигмент коричневато-желтый-серый,Агар-агар с крахмалом Придхэма. Развитие культуры хорошее, Субстратный мицелийкоричнево-желтый. Воздушный,мицелий светлый розовато-серый, развитие умеренное. Растворимый пигмент серо-желтый, слегка коричневатый.Синтетический агар-атар Чапека с глицерином, Развитие хорошее, Субстратный мицелий желто-коричневого цвета, хорошо развитый. Растворимый пигмент довольно интенсивный, желтый, слегка коричневый.Синтетический агар-агар Чапека с сахарозой. Субстратный мицелий хорошо развит,желто-коричневый.Картофельная среда. Развитие хорошее.Субстратный мицелий развит хорошо, от серовато-желтого до черновато-коричневото.Воздушный мицелий от беловатого до розова.то-серого, развитие умеренное. Растворимыйпигмент в куске картофеля от желтовато-серого до черноватого, жидкость - светло-желтая.Морковная среда. Степень развития умеренная, Субстратный мицелий серовато-коричневато-желтый. Воздушный мицелий с беловатыми,полосами. Растворимый пигменткоричнввый в моркови и желтый - в жидкости.Чистый желатин 12%-ный. Культура хорошо развита на поверхности в точке коатуляции. Обратная сторона колошений черноватокоричневая. Воздушный мицелий серый, хорошо развит. Растворимый пигмент коричневожелтый, начиная с поверхности и распространяясь,в зоне разжижения.Бульон глюкоэно-нитр атный Диммика,Развитие среднее. Образует кольцо и пленкуот беловато-желтого до светло-желтого. Растворимый пигмент довольно обильный, оветложелтый. Воздушный мицелий отсутствует.Снятое молоко. А. При теипературе 26 С -хорошо развитое кольцо желтого цвета; воз 5 10 4душевный мицелий и растворимый,пигмент отсутствуют;Б. При температуре 37 С - слабо развитое кольцо коричнвво-желтого цвета. Воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.Желатин - медленное неполное разжижение.Малеат кальция растворяет хорошо.Тирозин - видимое растворение отсутствует.Крахмал гидролизуется,Положительная реакция нитрита в течение перовых 24 час.развития культуры, затем15 быстро, переходящая в отрицательную.Молоко, медленно пептонизируется без коагуляции при 26 С.Сероводород не образует.Оптимальная температура роста штамма20 25 - 35 С,Способ,получения антибиотика осуществляют следующим образом,Культуру Ягер 1 огпусез сапайепз 1 з 1 ч"ЯКЕ3155 вырашикают в глубинных условиях вферментационном аэробном процессе на питательной среде, содержащий источники углерода и азота, минеральные соли и стимуляторыроста.В качестве источника углерода можно использовать гидраты углерода, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, декстрины, крахмал,меласса, различные виды алкогольного сахара, органические кислоты - молочная, ли.монная, винная, некоторые животные или ра.стительные масла.В качестве источника азота могут бытьиспользованы нитраты, минеральные и органические соли аммония, мочевины, аминовыекислоты, а также казеин, лактальбумин, глю 40 тен и их гидролизаты, мука соевая, рыбная иарахисовая, мясные экстрактыдрожжи,Из минеральных солей питательная средаможет содержать сульфаты, хлориды илифосфаты щелочных или щелочноземельных45 металлов, карбонаты кальция или магния, атакже акгиваторы роста - соли цинка, кобальта, железа, меди и марганца.Ферментацию прэводят при температуре25 - 35 С, рН среды 6,5 - 7,5 и скорости аэра 50 ции 0,3 - 2 л/л мин. Максимальный выходантибиотика через 4 - 9,дней культивированияв зависимости от используемой среды.Антибиотик выделяют из культуральнойжидкости известными приемами с учетом его55 физических, химических и биологическиховойств.Активность антибиотика определяют методом диффузии, используя Яар 11 у 1 ососецз ац.гецз 209 Р,в качестве тест-организма.50 Антибиотик 8.036 К, Р. является сильнойкислотой, нейтральный эквивалент которой775 (рКа - 4,45).Элементарный состав, %: С 47,9; Н 7,1;0 38,3; И 4,5; Р 2,2.55 Молекулярный вес выше 5000.,5физические свойства. Аморфный белый порошок. Точка плавления 235 - 236 С с разложением, выше 180 С приобретает коричневую окраску.УФ-опвктр, определяемый, начиная с раствора 50 мг/л, в воде (толщина 1 см), не имеет характерных ма 1 ксимумов, коэффициент ПОГЛОщЕНИя Х 11;и уВЕЛИЧИВаЕтСя От 0 дО 40 В интервале от 400,до 210 нм,Минимальная бакте- риостатическая концентрация,лкг/см Вид бактерий ЯарЬуососспя апгепя, штамм 209Р-АТСС 6538 РЯарЬуососсця ацгеця, штамм 133ЯарЬуососспя ацгепя, штамм СмитЗагспа цтеа - АТСС 9341Игер 1 ососсця 1 аеса 11 я - АТСС 9790Ягер 1 ососсця чг 1 дапяЯгер 1 ососспя руодепея Ьегпоу 1 сця,штамм Диг 7Ь 1 е 1 яяепа допоггЬаеае (А 50)Ь 1 еяяег 1 а гп 1 п 1 па 11 дя (5813)Вир 1 ососспя рпепгпоп 1 ае, штамм ТильВас 1 ця япЬИ 1 я - АТСС 6633Вас 111 ця сегеця - АТСС 6630МусоЬас 1 епшп ярес 1 ея - АТСС 607МусоЬас 1 епцгп рага - ягперпа 1 я (А 75)ЕясЬегсЫа со - АТСС 96375 Ы деа дуяептег 1 ае - Яира 1.Яагпопеа рага 1 урЫ АЯа 1 гпопе 11 а ясЬоИпше 11 ег (паратиф В)ФоженсРго 1 епя чпдатяК 1 еЬя 1 е 1 а рпецгпоп 1 ае - АТСС 10 031Ряецдогпопдя аегцрпояа, нггамм ВассВгпсе 11 а ЬгопсЫяер 1 са (СЬ - 387)Рая 1 епге 11 а гпц(осда (А 125)Тгеропегпе де Ке 11 ег 0,95 0,50 1,00 70,001 Й-спектр в бромистом калие представлен на чертеже, на котором по оси абсцисс с одной стороны нанесена .длинна воли в микронах (нижняя цвикала), а с другой стороны частота волн в ом -(верхняя шкала), по оси ординат - оптические плотности.Химические свойства. Антибиотик 8.036 К. Р. легко растворим в воде, диметилформамиде, пиридине, уксусной кислоте; малорастворим или нерасгворим в этаноле, ацетоне, хлороформе, н-гексане.В 1%-ном водном растворе устойчив при рН,в,пределах от 6,до 10,Антибиотик дает отрицательные тесты при следующих реакциях: биуретовой, Миллона, Поли, Адамкевича, Эрлих-Салковского, на хлорное железо, ксантопротеиновой, на железистый малтол, Полленса, Мернера, Циммермана и Бито, диазотирования.Дает положительные тесты при следующих реакциях: на нигридин (слабо 1 положительную до гидролиза, очень сильную после кислотного гидролиза), Молиша, Фолен-Дени, Са 1 кагучи после кислотного гидролиза, на перманганат калия до гидролиза (отрицательный тест после гидролиза), на динитро,4, на фенилгидразин после кислотного гидролиза, Фе 0,006 До 370 (л)55 Среду с рН 6,2 стерилизуют 40 мин барботированным паром при 122 С, После охлаждения объем бульона составляет 400 л, рН 7,1. Бульо 1 Засева 1 от 40 л инокулята из ферментера 1.60 Культура созревает 156 час при 27 С и перемешивании турбиной, вращающейся со скоростью 260 об/мин, пои скорости аэрацич 15 ма/час, рН среды 7,25.. Активность культуральпой жидкости 65 1625 ед/сма лизинга после кислотного гидролиза, реакциях Биала, Таубера, Эльсона-Моргана после кислотного гидролиза, Дише и Боренфрейнда, Селивано 1 в-Роэ, Пехмана, .реакции на серни стый иидол, на цистеин-карбазол, на железосинеродистый калий и хлорное железо.Бактериостатичеокую активность антибиотика 8.036 К. Р. определяют методом разведе-.ния. Результаты различных определений 10 представлены в таблице, где минимальныебактериостатичеакие концентрации выражены в микрограгммах вещества на 1 ом опытной среды.Обладает высокой актианостью в отноше нии грамположительных микроорганизмов инекоторых грамотрицательных.По своему действию он не перекрещивается такими антибиотиками, 1 как пенициллин, стрептомицин, тетрациклин, хлорамфеникол, 20 спирамицин, карбомицин, эритромицин, 1 пристинамицин и новобиоцин.Антибиоти 1 к обладает большой продолжительностью,действия и слабой токсичностью.П р н м е р 1. В ферментер 1 емкостью 25 170 л загружают (г):КХ-амин типа Е 1200 Мясной экстракт 720 Гидр атированная глюкоза 1200 Соевое масло 60 (мл) 30 Агар-агар 120Вода До 150 (л)После установления рН среды 7,05 добавлением 90 см 10 н, соды смесь стерилизуют 40 мин посредством барботирования паром при 122 С. После охлаждения объем бульона составляет 120 л, а рН - 6,9. Затем производят посев 200 см Ягер 1 огпусез сапайепв 18, подготовленной в колбе Эрленмейера при пе.ремешивании.40 Культура развивается 32 ч при 27 С, постоянном перемешивании и аэрировании сте.рильным воздухом.Производственную культуру лолучают вферментере 2 емкостью 800 л, загруженном 45 питательной средой следующего состава (кг);Отмоченная кукуруза 8,0 Гидратированная глюкоза 4,0 Соевое масло 8,0 (л) Углекислый кальций 4,0 50 Сульфат аммония 0,4Хлористый гексагидраткобальтаВода7П р и м е р 2, Ферментер 2 с культуральной средой, описанной в примере 1, засевают инокулятом. Культивируют 156 ч при 33 С, постоянном первмешивании турбитной с 160 об/мин и скорости аэрации 25 м/час.рН среды 7,45, объем сусла 340 л.Активность культур альной жидкости 3215 ед/смзП р им ер 3. Культуральные жидкости, полученные по примерам 1 и 2, перемешивают, 740 л сусла с титром 2420 ед/см при рН 7,3 доводят до рН 2 добавлением 10 н, серной кислоты в ванне, оснащенной смесителем. После этого вносят 18,кт фильтровальной добавки.Смесь фильтруют через фильтр-пресс, и осадок от фильтрования промывают 250 л водопроводной воды, Фильтрат и неактивную воду отб 1 расывают. Остаток от фильрации помещают при перемешивании в виде суспензии в 388 л смеси метанола (268 л) и воды (120 л).рН Суапензии доводится до 7,добавлением 10 н. соды.Перемвшивание продолжается 1 час, а затем раствор фильтруют на фильтр-прессе, Фильтрат отделяют, а осадок промывают 150 л 70%-ного метанола, Фильтрат и промывка составляют вместе 530 л с активностью 3400 ед/см. Осадок выбрасывают. Алкогольный фильтрат концентрируют под пониженным давлением (20 мм рт. ст.) при 35 С до объема 5,2 л,Антибиотик выпадает при добавлении 40 л этанола. Выпавший антибиотик отжимают, промывают этанолом, а затем высушивают в сушильном шкафу под пониженным давлением (5 мм рт, ст,), Получают 885 г светлосерого продукта с титром 1790 ед 1 мг..Пр имер 4. 880 г неочищенного антибиотика, полученного в примере 3, растворяют в 20 л воды с рН 7. Водный, раствор фильтруют, затем пропускают через колонку Дощех (35 л) 1 Х 2 в хлористом цикле. Вытекающую жидкость удаляют, Смолу промывают 80 л воды, затем 80 л смеси воды с муравьиной кислотой (90: 10 по объему).,После этого промывают смесью метанол: вода: муравьиная кислота (80: 10: 10) и, наконец, смесью метанол: вода (80: 20).Антибиотик извлекают после всех этих операций 300 л смеси метанол: вода (80:20), содержащей 10 г/л хлористого калия. Среднюю фракцию, объем которой 120 лконцентрируют до объема 5 л под пониженным дав.лением (20 мм,рт. ст,) при температуре 40 С.Концентрат диализируют 24 час против дистиллированной воды сювозь мембрану из ,регенерированной целлюлозы с целью удаления минеральных солей и различных органических загрязнений,Диализированный раствор (6,8 л), содержащий весь извлеченный антибиотик, концентрируют под пониженным давлением (20 мм рт, ст.) до 0,8 л. К полученному, концентрату о 20 25 зо 35 40 45 50 65 60 65 8добавляют 5 равных ему объемов ацетона - выпадает калиевая соль антибиотика.После фильтрации, промывки и просушки в течение одной ночи при 35 С под давлением 2 мм рт. ст.,получают 195 г светло-коричневого порошка с активностью 5680 ед/мг.П р и м е р 5. 175 г продукта, полученного по примеру 4, растворяют в 3,5 л воды с рН 7. Водный раствор пропускают через (колонку Доспех (15 л) 1 Х 2 в хлористом цикле. Стекающую жидкость удаляют. Смолу последовательно промывают в 15 л дистиллированной воды, 20 л смеси воды с муравьиной кислотой (90: 10 по объему), 40 л смеси метанол: вода: муравьиная кислота (80; 10; 10). Антибиотик извлекают 75 л смеси метанол: : вода (80: 20), содержащей 10 г/л хлористого калия,Среднюю фракцию элюата (40 л) концентрируют до 1,1 л под пониженным давлением (20 мм рт. ст.) и температуре ниже 40 С, концентрат диализируют в течение 24 час против дистиллированной воды через мембрану вз регенерированной целлюлозы.Диализированный раствор, содержащий всю активность средней фракции (1,5 л), концентрируют под пониженным давлением (20 мм рт, ст.) до объема 200 см. К полученному концентрату добавляют 5 объемов ацетона для осаждения антибиотика в виде солей калия.Выпавший осадок отжимают, промывают ацетоном, просушивают в течение ночи при 35 С и пониженном давлении (2 мм рт, ст.).Пюлучают 98 г калиевой соли антибиотика в виде белого порошка с активностью 8000 ед/мг,Пример 6. 5 г калиевой соли антибиотика, полученной по примеру 5, в титром 8000 едАмг растворяют в 50 см смеси н-пропанол: вода (50: 50). Раствор поступает в колонку, содержащую в суспензии окись алюминия с рН 4 в смеси 1 н-,про,панол: вода (75; 25),Антибиотик извлекают из смеси порциями по 200 см н-,пропанол:вода (50; 50), затем по 200 см н-иропанол:вода:концентрированный аммиак (д = 0,925) (50: 49,5: 0,5 по объему).Вытекающая жидкость поступает частями по 10 см, и актиьность каждой части определяют биологической дозировкой.Обогащенные фракции элюата н-пропанол; вода (50: 50), фракции от 3-ей до 11-ой соединяют вместе и концентрируют при пониженном давлении (20 мм рт. ст.) и температуре не выше 40 С до объема 10 см.Концентрат разводят 10 ом,н-пропанола и 10 смз ацетона для осаждения антибиотика. Помысле фильтрациями, промывки ацетоном и просущки в течение ночи при 35 С и пони женном давлении (2 мм рт, ст,) получают 2,4 г калиевой воли антибиотика с активностью 9150 ед/мг.Обогащенные фракции элюата н-пропанол;556732 ВОО 750 7 РО 1 ООО Щ О,О О,г О,Ф ОО о,г 1 а оставитель Т. СмирновТехред М. Семенов Редактор Н, Хубларо орректор Л. Денискина аказ 580 Изд.586сударственного коми по делам изобр 13035, Москва, Жираж 563 сное ПО та Совета Министров СССРений и открытийРаушская,наб д. 4/5 ОТ, Загорский филиа 9: вода: концентрированный аммиак (50: 49,5; : 0,5), фракции от 23-ей до 40-ой, соединяют вместе и обрабатывают вышеописанным опособом.Получают 1,5 г слабо окрашенного порошка с актввностью 8500 едlмг.Формула изобретенияСпособ получения антибиотика, о т л и ч а 10ющийся тем, что культуру 51 гер 1 огпусез сапайепз 1 з 1 ЧКК 1. 3155 выращивают в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли 5 и микроэлементы, с последующим выделением и очисткой целевого продукта известными приемами.