Способ получения фиксированных на носителе биологически активных макромолекулярных соединений

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистических Реслублик(43) Опубликовано 2 2) 08. 12 осударственный комитетСовета Министров СССРпо делам изобретенийи открытий 33) 8,76.Бюллетень(45) Дата опубликования описаиия 25,06.77 Иностранць 2) Авторы изобретени итер Я ихаэль р Ваиманн (фРГ)я) и Хельмут Детер рек, Карлэльбек-Хохш нц Боч, Гюн эттео (Австр нн (ФРГ) Иностранная фирма(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИКСИРОВАННЫХ НА НОСИТЕЛ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИ НИИ ния, фиксиоованные на носителе путем адуниверсальными, так а легкэ элюирэваны. получения макромолекуобладающих биологическсированных на носителе являютс сорбции, н как могутИзвест ть сно способ нений лярных сое кой активы стью Изобретение относится к способу изготовления макромолекулярных соединений, обладающих биологической активностью, фиксированных на поверхности нерастворимого носителя. Обычно макромолекулярные соединения, фиксированные на поверхности носителя, либо адсорбированы, либо после активации материала подложки соединены ковалентно.Подобные поверхностные макромолекулярные соединения, фиксированные на носителе, на О пример ферменты, имеют значительные недостатки. В частности. их поверхностная концентрация невелика. Поскольку речь идет о биологическиактивныхмакромолекулярных соединениях, при фиксировании на поверхности чаще всего активность понижается.При поверхностном фиксировании на активированных или содержащих ионогенные группы носителях не все реактивные группы макромолекулярных веществ доступны, так что оо носитель содержит еще заояженные группы и плотность связи макромолекулярных соединений никогда не достигает ожидаемой велиины согласно числу способных к соединеио положений. Макромолекулярные соединезаключающийся в том, что биологически а тивный протеин подвергают взаимодействи в водном растворе с соединением, котороесодержит эпоксидную группу и способнуювступать в реакцию сополимеризации двойную связь, Затем полученный продукт сополимеризуют с акриламидом и бифункциональным мономером, способным образовывать поперечные связи, с образованием сополимерас биологически активным протеином,В этом сополимере биологически активный иротенн находится в состоянии распределения по всей массе. При этом распределение является статистическим, то есть наповерхности биологически активный протеиннаходится не в бэлее высокой концентрации,чем внутри сэпэлчмера.Свою полную активность биологически активный протеин может проявить лишь толькоВ качестве соединения Б можно применять большое число соединений в зависимости от способности к взаимодействию с макромолекулярным соединением А, а также от вида получаемых сополимеров. Если макро- молекула А содержит, например, аминокислоты, то применяют соединения, которые имеют способные к взаимодействию группы, такие как оксирангруппы, этиленимингруппы. галогенидгруппы, галогенидкислотные, азидкислотныеангидридкислотныегруппы.Дальнейшие примеры показывают применение для ацилирования или алкилирования аминогрупп в пептидную и протеиновую группы, таких соединений как альдегиды, гидразиды, оксазалэны, смешанный хлормуравьиный эфир, эфир угольной кислоты с вторичным фосфорнокислым эфиром, вторичным мышьяковым эфиром, гидроксинитриловый эфир уксусной кислоты, й -гидроксисукцинамид, р-нитрофенол, полигалэгенфенэлы, дициклогексилкарбодиимид и фенилтриазин.Кроме того, смешанные ангидриды угольной кислоты с серной кислотой, имидазолид угольной кислоты,.а: ",0 пзозрсте 1 п 10 устраняет указанный1001, П 01, (:по создает ВОЗМОЖНОСТЬ ТОГО,пто гос:. 1.Оч 0111 ческ 11 активный протеинР 11 СПОЛагаЕТС 51 В СВЯЗаННОГЛ СОСТОЯНИИ Наи верхнос; и Образовавшегося сополимера и.Ншь В нсз 11 ачите 11 ьном количестве находится вну 51 П 1 .;Ого сополимера. Это достигается пу.0;.,-Опо,пгптольногс применения материала, пр 0,1 ставлгпошего собой молекулярноегсито, п эр:,; кс то-:с го так малы, что примененнып биэлэгп 1 ески актиВный протеинможет проп 11 ка;"ь и пих,Г 1 р 01111 агаемгд 1 л способ изготовления макромолк упярпь х сэодппений, фиксированныхна носителе, состоит в том, что макромолекулярные соегцп 10 Н 1151 А сначала подверга 10 т.,Оаимсдейст 15 И 10 с ссодпнением Б, котороеимеет по меньшой мере одну функциональнуюгруппу, способну 10 сс единяться с макромолекуляонь 1 М соединепг 1 ем А и, кроме того, име 40ет по меньшей море. одпу способну 10 к полимеризации функциональную группу, затем дооавляют мо;1 скулярноо сито с такой степеньюсшивк 1. (Илп 1 азмерогн пор), что через него451 .Оя икп 10 т мслекуль 1 макромолекулярногосоедппения А и, в случае необходимости, спо 001 П 1 " сопэлимер 11 заци 11 мономер, молеку -шрнэе сите 51 аб хает в реакц 550 нной среде3затем ссуш ствляют полимеризацию заклю -ченн 1 ях внутри молекул 51 рного сита соединений,Таким образом, п 1 луча 10 т макрэмолекудярное соединен 1;е, 1,лпгспроиаппое на носителе, ксвалентн, с "язапное с 1 юверхностью час-.1 иц 110 лямер 11 зата, котоыпй проникает в частццы мэлекулярпых спт,Макромэлекулярные соединения А в сээтВетствии с изобретением - этэ протеин, особенно биологически актив пь 1 й протеин, ферг,1 ен с,- .- и паходг 1 тся на поверхност 11 сэппг,;:1: .1.;1 оскольку лишь тогда он оез пред.".-". т.:, 10 ступен для вешеств, несбхо.,: х .:,. Осу 1 еств 11 ения Взаимодействия. Б 10 Г 1:;: активнь;й протеин, заключенНг. ,"; ","1; ОПОЛИМЕРа, ПРОЯВ 71 ЯЕТ СВ 010 акти " Ост и"хь В Оч Онь малой степени и лиг ь и. и Определеннь х условиях. Эти услогия зак,псчаются В том, что необходимые пля реакции геп 1 ества должны иметь воз мож 1:Ос 51 Нрод 11 ффупдировать через поры сшито-.1 с;полимера и к тому же достигнуть сакх 10 чспногэ в сополимере активного ПООТ 01 д, СОВОГшепно ОчеВИдно, ЧТО ВЫСОКО "1: ,1: г;Й субс 1 рат не может проник пут.: . 1 ут 01 п;1 т 01"0 сспэлимера, нс даже 1: 10110 х, У.,.РПЬ;Е СУОСтРатЫ ВСтУПаЮт ВО , 1 а 1;м-. - . -.тп:.0 ;ень медленно, поскольку 01 епь,:,.; г.нэ посходит диффузия черезз ты, гормоны, и антитела, нуклеиновые кислоты, пептиды, порфирины, гемины, фосфатиды, цереброзиды, ганглюэзиды, глюкозиды и т.д, Сушественно, что макромолекула так велика, что она практически не может проникнуть в поры примененных молекулярных сит. Минимальная величина применяемых по изобретению соответствуюших макромолекул поэтому зависит от размера пор применяемых молекулярных сит, Особенно предпочитаемые макромолекулы - это биологически активные протеины, в частности ферментно-активные протеины. При использовании других макромолекулярных соединений в соответствии с имеющимися, способными к соединению функциональными группами, применяют другие подходяшие алкилируюшие и ацилируюшие агенты. В случае нуклеиновых кислот допускаются по существу те же самые активные группы, как те, что применяются при протеин ах и и ептид ах. Ос о бенно псд ходят здесь амиды кислот, такие как нормальный амид угольной кислоты, алкиламид, морофолид ит.д.Многофункциональное соединение Б может иметь Одну или несколько групп, способных к соединению с макромолекулярным соединением А. Оно имеет предпочтительно группь 1 одного вида.Кроме тэгэ, этэ соединение должно содержать группу, способную к полимеризации или пэликонденсации, Это, прежде всего, 52 62 -",двойные связи углерод-углерод, преимушественно, которые логут вступать в реакции гомополимеризации и сополимеризацяи, а также двойные связи углерод-кислород, как в карбонилгруппе и др; ОН - группы. изоцианатгруппы и капролактамгруппы и т.д,Примерами соединений Б являются: 2,3- -эпоксипрогиловый эфир акриловой кислоты, 2,3-бутеноксид, 1-аллилокси-( М -этилениминпропанол), ангидрид малеиновой10 кислоты, амилбромид, акрилоилхлэрид, 2,3 - -эпоксипропиловый эфир метакриловой кислоты, 2,3-эпоксипропиловый моноэфир малеиновой кислоты, 1-(аллилокси)-2,3-эпоксибутан и т.д. 16Применяемые молекулярные сита должны иметь размер пор, не позволяющий проникать макромолекулярному соединению А и позволяющий проникать внутрь полифункциональному присоединяюшемуся соединению Б. Пред - почтительно это г елевидные молекулярные сита на основе сшитых толимеров, такие как полиакриламидгель, сшить:й углевод, например сшитый декстран, агар и т,д. Способным к полимеризации мономером может быть 5 акриламид, метакриламид, эфир акриловой кислоты и метиловый эфир акоиловой кислоты, стирол и т.с. с сс ответствующим количествэм сшиваюшегэ агента, как например,/М М -метилен-бис-акриламида, тетраэтилен- д гликольдиметилкрилата или этилендиакрилата, дивинилбензэла и - д. Размер пэр регулиоуется колнчеством сшивающего агента, поичем с повышением этого количества радиус пор сита уменьшается. Предпсчти - ЗЬ тельны молекулягные сита на основе сшито - ге декстрана и производных акриловсй кислоты и метакриловой кислоты, особенно амида и эфира.Молекулярные сита перед пслимеризацией полностью или Частично подвергают набуханию, так как полимеризация или сополимеризация соединения Б должна протекать внутри молекулярчого сита и потому осуществляют набухание молекулярных сит та 45 ким образом, что поглощается раствор, в котором происходит соединение макромоле - кулярного соединения А с соединением Б, так что на поверхности молекулярных сит остается только макромолекулярная часть 50 продукта АБ. Объем реакционного раствора выбирают таким, что полного набухания молекулярных сит не происходит, так что этим обеспечивается прохождение окончательной полимеризации исключительно внутри молекулярных сит.Путем соответствующей комбинации молекулярного сита с соединением Б и способной к полимеризации системой, а также в случае необходимости растворителя, можно каждый раз ио желанию осуществлять полное заполнение и проникновение полимеризата в молекуляоное сито или только поверхностное проникновение при остающемсянезаполненном полом пространстве внутри молекулярных сит,Способная к полимеризации система вы -бирается каждый раз с учетом сохраненияв силе нужных свойств макромолекулярногосоединения А, к примеру ферментной активности, допускаемых условий полимеризации,особенно температуры полимеризации и полимеризационных свойств способного к полимеризации соединения Б. Если в качестве макромолекулярного соединения А применяют т.носительно термостабильную нуклениовуюкислоту, то можно пригодное для полконденсации при нагревачии сэединение Б р,нять в качестве единственного элемента системы полихлеризаци.Если макоомолекуляоное соединение это термочувствительньдй фермент, то целесообразно оаботать и условиях сополимеризации с применением подходящих сомономеров,напоимео, акриламида в присутствии низкотемпературных катализаторов иолимеризаци,например, перекисей и, в случае нео ходимости, ускорителей и сшивающих агентов.В качестве инициаторов используют обычныеинициаторы и катализаторы, применяемые вполимерной химии, которые не оказываютотрицательного влияния на активность макромолекулярного соединения А. В качествеинициаторов или катализаторов применяютсянеорганические или органические перекиси,азосоединения и т,д. Дополнительно могутбыть применены ускорители реакции, такиекак амины и др, При применении производных акриловой или метакриловой кислот вкачестве соединения Б, обладающего сновсобностью к полимеризации, оказалось наиболее удобно применить комбинации инициаторов из пероксидисульфата и амина,Применение сшивающих агентов в полимеризационной системе не является необходимым, так как полимеризация внутри яче -ек молекулярных сит придает получаемомуполимеру свойства сетчатого полимера. Однако для модификации физических свойстввсе же целесоооразно применять сшивающий агент,Полученное фиксированное на носителе макромолекулярное : иие имеет пре - восходную повеох ,активность.Прим11 схоМолекуля 1:, снт, .:,основе образующего сетчатыес".эку,а, декстрана.Глю аа - э сдаза (220 1 Л /мг)35 ьоэмц 11 ан.1 5 т сефадекс 1" -25 среды добавляют 75 ми воды н 100 мл 25%-ного растооа -О;мц 11 ана. Значение рН становится равиым 11 н путем дозирования 2 н, натР с 111 1 ЛО".о"111 поддерживают рН в течение45 О к 11 н 1.стоянным. ПромыВают О, М раст 1 О 1;эк. Лрокарбоната натрия, Сефадекс, актив,1, ов;:1 ный оромцианом, смешивают с 200 мг Глюкозы - оксидазы, растворенной В 10 м,5 М триэтаноламин-буфера,рН 8,0. 50 Геакцно 111 ую смесь оставляют на 18 час .;ри: С, Промывают 0,2 М дифосфат-буфером, рН 7,5, Удельная активность полученного т,ч 1 м обоазом фермента, соединенного с чоси 1, -ем, составляет 38/г.551- сак 11 ня фиксирования протеинов на сшитом акт;1 лированием бромцианом полисахари;.е:ассматр 11 вается как способ с сохранением не 1111.1 сшей актиВнОсти, СпаВнение примеров 1 и 2 псказывает что, .несмотря на уд 7М К -метилен-бис-акриламид1Хлорид акриловой кислотыХлористый метиленДисульфат пеоекиси аммония.Й -Диметпламинопропионитрил. 51 00 м г глюкозы - оксидазы растворяютв 5 мл 0,5 М триэтаноламин-буфера, рН 8,0и в атмосфере азота охлаждают до 10 С.К этой реакционной смеси добавляют 0,03 млхлорида акриловой кислоты в 2 мл метиленхлорида и 30 мин перемешивают, В этомпротеиновом растворе, обработанном хлоридом акриловой кислоты, растворяют 0,8 гакриламида и 0,05 г М, М -метилен-бис-акриламида. Проводят полимеризацию 5с 0,05 мл 5%-ного й - циметиламинэпропионитрилового раствора, а также с0,05 мл 5% - нъ 1 м раствооа перекиси дисульфата аммония, Сразч после этого дооаВля 10 тк реи 1 ш:011 иэй смес 11 5 Г молекулярных сит Я(сэфадокс С; -25 среда) и перемешиваютв атмосье 1 е азота.Объем реакционного раствора ьыбираюттаким образом, чтобы его было недостаточно для полного набухания молекулярных сит 25и не О:разовалос 1, единого полимеризационного блока, но произошла чолимеризация исключительно в гранулах молекуляоных сит,Полученные частицы суспендируют в 50 млдистиллированной воды, перемешивают, фильт руют и лиофилизируют,Выход: Молекулярные сита Са. 5 г 1 впересчете на лиофилизат), Удельная активность 160 1./г лиофилизата,П р и м е р 2 1 для сравнения).Исходн 1,1 е и 1 одук 1 ыСефадекс-25, средаГ;покоза - оксидаза 1220 О /мг) военное количество фермента, содержащегося на носителе, по известному способу получен продукт с активностью на 25% ниже активности, полученной по предлагаемому способу. Полученный на введенном ферменте выход активности в 8 раз выше.Пример 3.Исходные продукты:Молекулярные сита на основе полиакриламида.Глюкоза-оксидаза (220 О /мг)А криламидМ, М -метилен-бис-акриламидХлорид акриловой кислотыМетиленхлоридДисульфат перекиси аммония11 -диметиламинэпрэпиэнитрил.Инкубирование раствора фермента производят, как указано в примере 1, Сразу после добавления раствора инициатора добавляют 5 г молекулярных сит биогель Р 6 50- 100 меш) и перемешивают в атмосфере азота, Набухание молекулярных сит происходит в течение нескольких секунд.Объем реакционного раствора выбирают таким образом, чтобы не было достигнуто полного набухания молекулярных сит, чтобы не образовался единый полимеризационный блок, а полимеризация протекала исключительно в гранулах молекулярных сит. Полученные частицы суспендируют в 500 мл дистиллированной воды, энергично перемешивают и фракционируют двумя типами сит с шириной ячейки 0.4 и 0,2 мм. Настицы 0,2-0,4 мм заполняют колонку диаметром 20 мм и элюируют 4 л 0,2 М фосфат-буфера; рН 7,5.Выход, Молекулярные сита Са. 5 г в пересчете на сухую массуудельная активность 160 1-1/г (в пересчете на сухую массу),П р и м е р 4. Фиксацияпэлиаденилэвэй кислоты (поли А)Исхэдные продукты:Поли АТриэтвноламинбуфер 0,5 М, рН = 8,0) АкрилоилхлоридЭфирАкриламидДисульфат перекиси аммония 15%)Я, Н -бис-акриламид1Диметиламинопропионитрил5% )Сефадекс 1".1 -25, среда.274 мг Поли А растворяют в 2 мл триэтаноламин-буфера и охлаждают до 10 С. Этот реакционный раствор добавляют в атмосфере азота в 0,01 мл ак 1 илоилхлорида, растворенного в 1 мл эфира и перемешивают 30 мин, Окончательно смешивают с 0,3 г526294 10 Составитель Г. РусскихТехРед Н. Бабурка Корректор Н. Ковалева Редактор Н, Джарагетти Заказ 919/67 Тираж Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и откоытий 113035, Москва, Л(-35, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г, Ужгооод, ул. Проектная, 4 акриламида и 0,2 г И, Ь -метилен - бис-акриламида и 2 г сефадекс-25 и начинают полимеризацию с 0,02 мл диметиламинопропионитрила и 0,02 мл дисульфатаперекиси аммония. Полученный продукт в гра 5нулах вводят около 8 час в колонну и промывают 2,5 л 0,5 М раствора поваренной солиДля доказательства фиксирования суспендируют сефадексом соединенный Поли А в0,3 н. раствора едкого калия и гидролизуют 10ов темноте при 37 С,После гидролиза получают нуклеиновуюкислоту, концентрация которой 10%) вычислена по привесу Поли А,Предложенный способ дает возможность Лэкономить дорогой и во многих случаях труднодоступный биологически активный протеин,поскольку он весь связывается на поверхности,Формула изобретенп я 201. Способ получения фиксиров .-.,юносителе биологически активных мак:олекулярных соединений путем взаимодействиябиологически активного макромолекулярногосоединения А с низкомолекулярным соединением Б, содержашим по меньшей мере однугруппу, способную к полимеризации, и поменьшей мере одну группу, способную к взаимодействию с макромолекулярным соединением А, с последующей полимеризацией продукта взаимодействия АБ в растворе, о т -личаюшийся тем,что, сцельюувеличения биологической активности фиксированного на носителе соединения, к раствору продукта АБ перед полимеризацией добавляют молекуляоное сито с размером пор в набухшем состоянии, меньшим размера молекулы макромолекулярного соединения А, в количестве, достаточном для неполного набухания в растворе продукта АБ.2. Способ по и. 1, отличаю - ш и й с я тем, что полимернзацию продукта АБ прсводят в присутствии сополимеризуюшегося с ним соединения.