Способ получения суммы фенольных соединений

(5 61 К 3578 ИЕ ИЗО ЕНИ ОПИС ВТ ий инст йшева МЫ тической зводства тельного наземную Ыа )Ьег)са арате СоГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(56) Авторское свидетельство СССМ 709091, кл, А 61 К 35/78, 1977,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУМНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ(57) Использование: в фармацепромышленности, касается проилекарственных средств из растсырья, Сущность изобретения:часть молочая грузинского Еорйогобезжиривакл хлороформом в апп Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается производства лекарственных средств из растительного сырья.Цель изобретения - упрощение и сокращение продолжительности способа, увеличение выхода целевого .продукта, повышение активности целевого продукта.Поставленная цель достигается тем, что способ получения суммы фенольных соединений из надземной части молочая грузинского (ЕорЬогЫаЬег)са) осуществляют путем обезжиривания сырья хлороформом в аппарате Сокслета методом непрерывной экстракции (до исчезновения зеленой окраски хлороформа, вытекающего из экстрактора аппарата Сокслет) с последующим "подсушиванием" сырья под тягой, затем одновременно осуществляют измельчение кслета до исчезновения зеленой окраски хлороформа, вытекающего иэ аппарата, и подсушивают сырье. Затем осуществляют одновременное измельчение и экстрагирование 96-ным этиловым спиртом при соотношении сырья: экстрагент 1:15-1;20 методом вихревой экстракции, затем экстрагируют методом непрерывной экстракции горячим 96-ным этанолом для менее 30 мин. Полученный экстракт отделяют от шрота фильтрованием, фильтрат упаривает под вакуумом и высушивают. Положительный эффект; упрощение и сокращение продолжительности процесса, увеличение выхода и повышение активности целевого продукта.и экстрагирование сырья 96-ным этиловым спиртом при соотношении сырье: экстрагент в интервале 1:15 - 1:20 способом вихревой экстракции, затем экстрагируют методом непрерывной экстракции горячим 960-ным этанолом не менее 30 мин. далее экстракт отделяют от шрота фильтрованием через бумажный фильтр, фильтрат упаривают под вакуумом и высушивают остаток при 700 С.. В литературе мы не нашли сведений об аналептическом действии флавоноидов,В предлагаемом способе вихревая экстракция сырья осуществляется в приборе "Мельэкстрактор", где одновременно происходит два процесса: измельчение и экстракция; причем, благодаря наличию двух пар ножей, расположенных горизонтально и под углом 45 к рабочей оси прибора, 1819618измельчение сырья идет по всем направлениям с разрывом клеточных стенок, что способствует дополнительно извлечению полифенолов не только из межклеточного, но и из внутриклеточного сока, а следовательно, зто способствует увеличению выхода целевого продукта, За счет высокой скорости перемешивания в максимально короткий срок наступает равновесие в сис 10 теме сырье: экстрагент, что значительно сокращает . продолжительность технологических процессов.Дальнейшее экстрагирование сырья в аппарате Сокслета горячим этанолом спо 15 собствует максимальному извлечению суммы.фенольных соединений из сырья.Способ поясняется следующими приме-. рами конкретного выполнения,П р и м е р 1. 100 г надземной части молочая грузинского подвергали обезжириния остатков растворителя, после чего сырье загружали в прибор "Мельэкстрактор", заливали 1,5 л 96-ного этилового спирта (комнатной темперагуры) и перемешивали в приборе "Мельэкстрактор" при 30 скорости. вращения измельчэющих ножей 8000 обор./мин в течение 5 мин. Затем сырье с экстраген 1 ам переносили из стакана прибора "Мельэкстрактор" в аппарат Со 35 кслета и далее в нем экстрагировали сырье методом непрерывной зкстракции при температуре кипения этилового спирта в течение 30 мин, Затем экстракт отделяли от шрота фильтрованием через бумажный фильтр, Фильтрат упэривали примерно до 40 50 мл под вакуумом и сушили остаток в вакуум-сушильной шкафу. Выход суммы фенольных соединений27,65 к сырью, т.е. 27,65 г иэ 100 г сырья,Общая продолжительность процесса -2 ч.Целевой продукт- сумма фенольных соединений из молочая грузинского - представляет собою порошок бурого цвета со специфическим запахом и горьковато-кис-. 50лым вкусом; растворим в воде, этаноле. П р и м е р 2. 100 г надземной части молочая грузинского подвергали обезжиривэнию в аппарате Сокслета с 0,5 л хлороформа до тех пор, пока хлороформ, 55 вытекающий из экстрэктора аппарата Сокслета, не станет бесцветным, Затем сырье "подсушивали" в вытяжном шкафу до удаления остатков растворителя, после чего сырье загружали в прибор "Мельэкстрак 20 ванию в аппарате. Сокслетэ с 0,5 л хлороформа до тех пор, пока хлороформ, вытекающий из экстрактора аппарата Сокслета, не станет бесцветным, Затем сырье "подсушивали" в вытяжном шкафу до удале тор", заливали 1 л 90-ного этилового спирта (комнатной температуры) и перемешивали в приборе,"Мельэкстрэктор" при скорости вращения измельчающих ножей 6000 обор,/мин в течение 3 мин, Затем сырье с экстрэгентом переносили из стакана прибора "Мельэкстрактор" в аппарат Сокслета и далее в нем экстрагировали сырье методом непрерывной экстракции при температуре кипения этилового спирта в течение 15 мин. Затем экстракт отделяли от шрота фильтрованием через бумажный фильтр. Фильтрат упаривали примерно до 50 мл под вакуумом и сушили остаток в вакуум-сушильном шкафу,Выход суммы фенольных соединений составляет 27,56 к сырью, т.е. 27,56 г из 100 г сырья,Общая продолжительность процесса 2 ч.П р и м е р 3. 100 г надземной частимолочая грузинского подвергали обезжириванию в аппарате Сокслета с 0,5 л хлороформа до тех пор, пока хлороформ, вытекающий из зкстрактора аппарата Сокслета, не станет бесцветным. Затем сырье "подсушивали" в вытяжном шкафу до удаления остатков растворителя, после йего сырье загружали в прибор "Мельэкстрактор", заливали 2 л 96-ного этилового спирта (комнатной температуры) и перемешивали в приборе "Мельэкстрактор" при скорости вращения измельчающих ножей 10000 обор./мин в течение 8 мин. Затем сырье с экстрагентом переносили из стакана прибора "Мельэкстрактор" в аппарат Сокслета и далее в нем экстрагировэли сырье методом непрерывной экстракции при температуре кипения этилового спирта в течение 45 мин. Затем экстракт отделяли от шрота фильтрованием через бумажный фильтр. Фильтрат упаривэли примерно до 50 мл под вакуумом и сушили остаток в вакуум-сушильном шкафу при 70 оСВыход суммы фенольных соединениИ составляет 27,64 к сырью, т,е. 27.64 г из100 г сырья.Общая продолжительность процесса 2 ч, П р и м е р 4(по способу-прототипу). 100 г измельченной надземной части молочаягрузинского заливали смесью хлороформ:спирт(9:1) в количестве 1 л и экстрамровали на кипящей водяной бане 6 ч. Полученные экстракты (6-кратная экстра-. кция) объединяли (5,5 л), упаривали на водяной бане до 1/10 (0,5 л) объема, а затем . проводили доотгонку в вакууме досуха. Остаток растворяли в 20 мл этанолэ, прибавляли 60 мл дистиллированной воды, перемешивали и кипятили 30 мин с водяным холодильником. Далее остывший раствор5 10 20 25 35 40 50 55 б) к 5 мл приготовленного раствора добавляли 3 мл 5-ного раствора карбоната натрия. Появление фиолетового окрашивадекантировали с образовавшегося осадка(повторили 4 раза), Полученные водно-спиртовые вытяжки обьединили и упаривали ввакууме досуха.Выход целевого продукта составил 9,17г, или 9,17 к сырью.Общая продолжительность способа - 48 ч.Нами изучена зависимость выхода суммы фенольных соединений от ряда технологических параметров (табл, 1, 2, 3).Из табл, 1 следует, что оптимальнымсоотношением сырье: Экстрагент являетсяпредел 1:15-1:20, при этом обеспечиваетсянаибольший выход суммы фенольных соединений.Из табл. 2 следует, что оптимальнойконцентрацией экстрагента - этиловогоспирта является 96;, т,к. это обеспечиваетнаибольший выход суммы фенольных соединений.Из табл. 3 следует, что максимальныйвыход суммы фенольных соединений обеспечивается при продолжительности экстраги рован ия горячим эта нолом припродолжительности не менее 30 мин.Полученная сумма фенольных соединений была подвергнута качественному анализу:1. Реакция с цинком,в среде солянойкислоты (на флавоноиды) 0,50 г полученной 3суммы фенольных соединений растворяли в10 мл 96-кого этилового спирта, к раствору добавляли небольшое количество (30-50мг) цинковой пыли. Раствор нагревали наводяной бане до кипения и оставляли на 10мин. Раствор окрашивался в красный цвет,что свидетельствовало о наличии флавоноидов,2. Реакция накатехины0.50 г полученной суммы фенольных соединений растворяли в 20 мл воды.а) к 10 мл приготовленного раствораприливали 5 мл 2-кого раствора хлорногожелеза, появляется зелено-черное окрашивание (катехины), 4б) к 10 мл приготовленного растворадобавляли 5 мл 2-ного раствора ванилинав.соляной кислоте, появляется малиновое.окрашивание (катехины).3) Реакция на антоцианы0,4 г суммы фенольных соединений растворяли в 10 мл 96-ном этанола.а) к 5 мл приготовленного раствора добавляли 3 мл 2-ного раствора ацетатасвинца. Появление красного осадка свидетельствовало о наличии антоцианов,ния свидетельствовало о наличии антоцианов,.4. Реакция на антраценпроизводные 0,5 г суммы фенольных соединений растворяли в 5 мл 10 ф-ного раствора едкого натра, кипятили 5 мин, После остывания смесь разбавляли 5 мл воды и фильтровали.3 мл фильтрата помещали в пробирку, добавляли 3 мл 10-ного раствора соляной кислоты и 10 мл бекзола, Осторожно перемешивали и после расслоения жидкости сливали бензольный слой, фильтруя его через небольшой комочек ваты. Фильтрат встряхивали с 3 мл 10-кого раствора аммиака. Аммиачный слой приобретал вишневое окрашивание, что свидетельствовало о наличии антраценпроизводных,5. бумажная хроматография для идентификации флавоноидов и их гликозидов.0,5 г суммы фенольных соединений растворяли в 20 мл воды и этиловым эфиром извлекали флавонолы. Эфирный слой отделяли от водкого раствора, упаривали, В водном растворе содержались гликозиды флавонолов,а) флавонолы в эфирном слое анализировали методом бумажной хроматографии (восходящий способ хроматографирования) в системе растворителей; н-бутанол-уксусная кислота-вода (4.1:5), Пятна ка хроматограмме были идентифицированы по их окраске в УФ-свете и по значениям Вг в сопоставлении с известными стандартными образцами. На хроматограмме было обнаружено 3 пятна с В = 0,78; 0,55; 0,58. пятнос Вг= 0,78 имело в УФ-лучах желтую окраску, два других пятна - коричневые окраски, Пятка в сравнении со свидетелями идентифицированы как кверцетин (В 1=0,78); гиперозид (В = 0,55), изокверцитрин (В = 0,58).б) Флавоноловые гликозиды, содержащиеся в водном растворе анализировали методом бумажной хроматографии (нисходящий способ хроматографирования) в системе растворителей: этилацетат-пиридин-вода(2;1:2), проявителем служил кислый анилинфталат, На хроматограмме было обнаружено 1 пятно с В,175, которое в сравнении с достоверным образцом свидетеля было идентифицировано как галактоза.Выделенная сумма фенольных соединений подвергалась изучению острой токсичности и аналептическаму действию.Острая токсичность изучалась по методу Кербера на белых мышах при внутрибрюшинном введении исследуемых . соединений в обьеме 1 мл водного раствора, Максимальная доза исследуемых соединений, возможная для введения, составившая 6000 мг/кг массы тела животного, ке вызы вала гибели животных, что позволило считатьО,о 6000 мг/кг, Согласно классификации токсичности по Сидорову К,К, (1973) исследуемые соединения следует отнести к группе относительно безвреднь 1 х веществ,Аналептическая активность изучалась на модели нембуталового сна, Известно, что большие дозы барбитуратов, в частности, нембутала (25 мг/кг массы тела) вызывают угнетение дыхания и сердечно-сосудистого центра В продолговатом мозгЕ, в внутривенное введение приводит к остановка дыхания и резкому снижению артериального давления,Эталонным препаратом для сравнения аналептической активности был Вьбран кофеин-бензоат натрия в дозе 10 мг/кг массы тела (внутрибрюшинное введение), По современным данным этот препарат си носится к группе как психотропных, так и к группе аналептических средств, Кофеин-бензоэт натрия оказывает аналептическое дейстоие; ослабляет действие снотворных и наркотических средств, повышает рефлекторную возбудимость спинного мозга, Возбуждает дыхательный и сосудодвигательный центры. Это лекарственное средство предложено использовать В кача- стае стандарта при изу Гении эналептической ак Гивн ости.Эксперименты были проведены нэ крысах-самцах массо" 190-240 Г. О;.:,Поооеменно ставилось несколько серий экспериментов. В каждой серии по шееь животных (п=-б), Первая серия - контроль (внутрибрюшинно вводили физиологи еский раствор), Вторая сериястандартная - (внутрибрюшинно вводили кофеин-бензоат натрия в дозе 10 мг/кг), ретья серия - опытная .(Внутрибрюшинно вводили иссле" дуемые соединения - сумму фенольных соединений молочал грузинского - в дозе 10 мг/кг). Физиологический. раствор, стандарт и исследуемую сумму фенольных соедине" ний оооДили за 30 мин До ВВед 8 ния нембу- ТЗЛЯ, ДОЗЫ СТЯНДЭРТЭ И ИССЛСДУ 8 МУХ фенольных соеДинений подбирались по эффектуОБО, Резульгаты экспериме .товпредставлены В табл. 4,Таким образом, в результзте проведен. ных экспериментов установлено, что кофеин-бензоат натрия снижает продолжительность сна крыс на 26,82 по сравнению с контролем, а исследуемая сумма фенольных соединений молочая соответстоенно - на 50,07, т.е. сумма фенольныхсоединений молочая проявляет аналептиче 5 скую активность, превышающую на 23,25(50,07 - 26,82 = 23,25) активность стандартного препарата - кофеина-бензоата натрия, Полученные результаты являютсядостоверно значимыми,10 Итак, описанный способ обеспечивает:1, Упрочнение процесса получения суммы фенольных соединений. Способ прост ввыполнении, исключает многостадийность,В то Время как способ-прототип включает в15 себя шестикратную экстракцию, четырехкратную обработку остатка,2. Продолжительность способа 2 ч, способа-прототипа 48 ч, т.е. тродолжительность данного способа в 24 раза меньше20 продолжительности известного.3, Повышение выхода целевого продукта, В данном способе выход суммы фенольн их соединен и й соста вл ч ет 27,65; кисходному сырью, .то в 3 раза превышает25 выход продукта в способе-прототипе(9,1 %) при использовании В качестВе сырьямолочая грузинского,4, Ровниение активности целевого г 1 рочукта Фенольнь,е Гоединения из молочяя30 Голученные пр 8 ДЛЯГаемым спОсОбОм, прО"являют эналептическуа активность, превышгнощую на 23,25, таковую активностьэталонного препарата - кофеина-бензоатанатрия. Кроме того, фенольные соединения35 мслочая яоля 1 отся относительно безвредны. ми Гешествэми,Ф о р мул а изобретения Сособ получения суммы фенольных со единений из растительногосырья путем экстра кции хлороформом, спиртом, упэривания и сушки экстракта, О т л и ч а ю" щ и й с я тем, что, с цель 5 о упрощения и сокращения продолжительности процесса, 45 увеличени 51 выхода и повышения активности целевого продукта, надземную часть мо- ЛочаЯ ГРУЗИНСКОГО ЕОРПОГЬа 1 ЬЕГСа одновременно измельчают и экстрагируют 96-ным этиловым спиртом при сООтнОш 8- 50 нии сьрье: зкстрагент 1:15 - 1:20 методомвихревой зкстракциизатем экстрагируют методом непрерывной зкстракции горячим 96/-ным зтанолом не менее 30 мин.1819618 Таблица 1 Влияние соотношения сырья:экстрагент на выход суммы фенольных соединений абл ица 2 соединений Влияние концентрации эти пирта на выход суммы фенол Таблица 3 Влияние продолжительности экстрагирования горячим этанолом в аппарате Соксле выход суммы фенольных соединений с Таблица лияние суммы фенольных соединений молочая грузинского на продолжительность нембуталового сна мин)