Способ получения полипептида со свойствами гирудина

(19) 1)5 С 12 И 15 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР Е ИЗОБРЕТЕН АТЕНТ рТ 6 1891, или рТ 6 1833, кодирующей НЧ 1 или НЧ 2, трансформацию полученными ДН К штаммов Басс вагап) нсез сегечзае, культивирование трансформированных дрожжей, выделение и очистку целевого продукта. Г)ричем эти плазмиды имеют следующие последовательности Ятг -ех - Яс - ген Н, где Н - ген, кодирующий гирудин НЧ 1 или НЧ 2, ЯТг - представляет собой промотор Рбй-дрожжей;ех-последовательность, обеспечивающая секрецию полового ферО- мона дрожжей; 5 с - последовательность, кодирующая участок расщепления протеина, один кодон АТ 6 или два кодона, кодирующих Яег - 1 ец - Азр -оз - Агд;ех последовательность представляе "пре-про" последовательность,выделяет половой альфа феромон д 2 табл.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ГИРУДИНА(57) Использование: генетическая инженерия и получение полипептида со свойствами гирудина, Сущность изобретения; способ предусматривает конструирование рекомбинантной плазмидной ДН К рТ 6 1828 - или т собой которая рожжей. Изобретение относится к генетической инженерии и в частности к способу получения полипептида со свойствами гирудина,Известен способ получения полипептида со свойствами гирудина, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей НЧ 1 или НЧ 2, трансформацию полученными ДНК штаммов ЯассЬагоп)усез сегеазае, культивирование трансформированных дрожжей, выделение и очистку предшественника гирудина с последующей активацией (1.Недостаток известной конструкции плазмидной ДН К состоит в том, что гирудин экспрессируется в форме предшественника, который имеет два сайта расщепления, Когда расщепление происходит по первому сайту, получают более длинную форму, чем активный гирудин, который отличается от ком длиненнымконцом.загрязняет зтадиях егоочистки и итого препа гирудина активного аминокислоты с ЙН 2- Предшественник рудин на различных это усложняет способ снижению выхода чидина. елыи гичистки и иводит к ата гируПредложенные плазмиды имеют только один сайт расщепления, расположенный перед М-терминальным концом гирудина. Расщепление в этом месте и позволяет получить сразу зрелый гирудин и избежать в дальнейшем энзиматического расщепления, или этапов обработки бромидом цианогена и ренатурации протеина,Целью изобретения является упрощение способа. Способ предусматривает конструирование рекомбинантной плазмиднай ДНК рТ 661828 или рТ 61891, или рТ 61833,(21) 4202962/13кодирующей НЧ 1 или НЧ 2, трансформациюполученными ДНК штаммов Яасспагоаусезсегечз 1 ае, культивирование трансформированныхх дрожжей, выделение и очистку целе-вого продукта, Причем эти плазмиды имеют 5следующую последовательность:Я 1 г - 1 ех-Яс-ген Нгде Н - ген, кодирующий гирудин НЧ 1 илиНЧ 2;Я 1 г - представляет собой промотор ге- .10. на РОКдрохокей;ех - последовательность, обеспечивающая секрецию полового феромона дрожжей;Яс - последовательность, кодирующая 15участок расщепления протеина;т,е. один кодон АТО или два кодона, кодирующихуз-Агд или пять кодонов, кодирующих Яег -ео-Азр- уз - Агдех последовательность представляет собой "пре-про" последовательность, которая выделяет половой альфа феромондрожжей.Хотя в данной конструкции последовательностьпроисходит от гена полового 25альфа феромона дрожжей, в принципе могут быть использованы другие системы (например, система белка Киллера),Последовательность Я 1 г означает промотор гена РОК дрожжей, который отличается от промотора гена М Ральфа 1, Впредложенном способе используют промотор гена РОК, что позволяет добиться экспрессии гирудина независимо от половогосигнала штамма-хозяина. 35Ппазмидные ДНК могут содержать, кроме того, начало репликации в дрожжах, например, начало репликации плазмиды 2Данные плазмиды обеспечивают репликацию в Е.соИ, например, начало репликации, такой как репликации рВЯ 322, имаркер селекции, например, армй. Этиплазмиды будут также нести маркер селекции дрожжей, например, ген, кодирующийустойчивость к некоторым токсичным химическим соединениям, или ген; ИЯАЗ.Для управления экспрессией и секрецией гирудина в культуральную среду, соответствующий ген вводят в вектор дрожжейили в плазмиду, содержащую начало реппикации в дрожжах, Плазмиды содержат следующие элементы;- начало репликации плазмиды дрожжей 2 р,- ген цгаЗ 55- начало репликации в.Е.соИ и маркерустойчивости к антибиотику- область 5 гена М Ральфа 1. котораясодержит промотор транскрипции, "лидер,ную" последовательность и последовательность пре-про предшественника фактора альфа, эта последовательность слита с последовательностью, кодирующей гирудин НЧ 1,- терминатор транскрипции гена РОК дрожжей, размещенный ниже гена гирудина. Данные конструкции вводят в дрожжи, в частности в Яасспагоаусез или в плазмиду для автономной репликации. или в хромосоме дрожжей.Когда плазмида является автономной, она содержит элементы, обеспечивающие ее репликацию, т,е, начало.репликацию такое. как у плазмиды 2,и. Кроме того, плазмида может содержать элементы селекции, такие как ген ИВАЗ или ЕЕИ 2, которые обеспечивают комплементарность дрожжей ОгаЗ ипи 1 ео 2, Эти плазмиды могут также содержать элементы, обеспечивающие их репликацию в бактериях, например, начало репликации, такое как у рВ 8322. маркерный ген, такой как Амр".Когда промотор является таким, как у гена феромона альфа, дрожжи будут предпочтительно полового типа Маарпа. Можно использовать, например, штамм гентипа игаЗ или )ец 2, или другой, комплементарный плазмиде, для обеспечения удержания плэзмиды в дрожжах при соответствующем давлении селекции,Получают гирудин культивированием трансформированные дрожжей в культу- ральной среде и выделяют его из культу- ральной среды в форме созревающего предшественника гирудина н Вго или и ч чо.Созревание может быть проведено в несколько этапов, Сначала расщепляют некоторые элементы, происходящие от трансформации последовательностиех, это расщепление проводится на уровне последовательности, соответствующей Яс, Зрелому гирудину предшествует селективное отщепление метионина бромидом цианогена. Последовательность, кодирующая гирудин, не содержит метионина.Предусмотрено отщепление на М конце депиптидауз-Агд. В некоторых случаях необходимо предусмотреть ферментативное расщепление после секреции при добавлении специфического фермента.8 некоторых случаях после обработки бромидов цианогена необходимо денатурировать белок, воссоздавая дисульфитные мостики. Для этого белок денатурируют, например гуанидинхлоридом, потом денатурируют в присутствии восстановленного и окисленного глютат-иона.В частности гирудин НЧ 1 используют в фармацевтических композициях, один или в10 20 25 30 35 40 45 50 55 сочетании с другими активными продуктами, или же в рамках тестов или диагностики 1 и чего или 1 п ч 1 чо.П р и м е р 1. Плазмида рТ 6897 несет информацию для предшественника гирудина, который содержит только один сайт расщепления для протеиназы узс 1=. В результате обработки протеиназой узсГ высвобождается молекула гирудина, удлиненная у ЙН 2 на 4 остатка 6 и Лэ С 1 о и А 1 а. Делеция фрагмента ДНК, кодирующего эту последовательность 61 ц и Аа 6 в Аа, приводит к получению зрелого гирудина, Эту делецию осуществляют с помощью сайт специфического мутагенеза 1 пчго.Плазмиду рТ 6897 гидролизуют Рз 11- Вц 61 рестриктазой. Ф рагмент ДН К, содержащий последовательность гирудина, клонируют в репликативной форме однониточного фага М 1 3 Т 6131, чтобы создать фаг М 13 Т 6 897.Гибридизируют олигонуклеотид последовательностии: 5-ТСТП 66 АТААЛА 6 ЛАТТАС 6 ТЛТАСА 6 АСс геном ной ДН К этого фага М 13 Т 6 897, Этот олигонуклеотид гибридизируется в своем первом фрагменте (15 пар оснований) с последовательностью из 5 пар оснований непосредственно выше делецируемой последовательности, а вторым своим фрагментом с последовательностью из 15 пар оснований непосредственно ниже. Этот олигонуклеотид служит матрицей для синтеза 1 п чсго комплементарной нити гекома фага М 13 Т 6897. После действия Т 4 ДН К лигазы полученными гибридными ДНК трансфецируют бактерию - реципиент М 103 / Ы /1 ас-Рго/ЯврЕ ТЬ Епс 1 А ЯЬсЬ 15 зтгА гК- пй+1 Г ТгаР 36 РгоАВ+ас 1 1 эс 2 ЬМ 15/ и анализируют фаги, полученные при этой трансфекции путем гибридизации ДНКДНК, испол ьзуя в качестве зонда нуклеотид, описанный ранее и меченый 32 р путем ЫпэОоп,П р и м е р 2, Получают плазмиду рТ 6876 после удаления Вцб 1 сайта в плазмиде рТ 6883, который находится вблизи терминатора транскрипции гена Р 6 К.Для этого частично гидролизуют эту плазмиду рТ 6876 с помощью Вц 11, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимеразы 1 Е.со в присутствии 4 нуклеотидов и ковалентно соединяют молекулы ДНК друг с другом при действии ДНК лигазы фага Т 4. Плазмида рТ 6883 имеет только один сайт Вце 11, расположенный выше промотора гена феромона. Плазмиду рТ 6883 (20 мг) обрабатывают Вд 1, потом подвергают гидролизу нуклеазой Ва 131 (1,4 единицы, 10 минут). Обработанную таким образом ДНК очищают последовательными экстракциями фенолом и хлороформом - изоамиловым спиртом, за.тем фракцию 5 мг) подвергают действию полимеразы Кленова, чтобы получить максимальное количество свободных концов. Обработанную таким образом ДНК лигируют с нефосфорилированными линкерами ВавН 1 /5,С 66 АТССС 6/ в присутствии лигазы фага Т 4. После трансформации Е.со 1106 и селекции на устойчивость к ампициллину выделяют плэзмиду рТ 6892, делецированную в области 5, располагающейся сбоку гена МГа 1 рйэ 1, линкер ВапН 1 локализован на основании выше АТ 6.5-С 666 АТССС 6 А АТ 6 А 6 А ТТТ линкер ВащН 1 Часть, кодирующэяМГарйа 1 - 2Новый фрагмент ВэвН 1 - Яа 11 клонируют между сайтами ВатН 1 - Яа 1 фага М 1 ЗТ 6120, чтобы получить фаг М 13 Т 6889. Из фага М 13 Т 6889 изолируют фрагмент ВэщН 1 - Щ 1, содержащий фрагмент, кодирующий феромон альфа, чтобы лигировать его с большим фрагментом Вц 11 плазмиды В рТ 6892 в содержит фрагмент Ваш Н 1 - Вд 11,соответствующий части, кодирующей феромон, вставленный позади сайта Вд 1 промотора гена Р 6 К.ДНК рТ 6892 содержит один сайт Вд 1, один сэйт Яа 11 два сайта епс ас 1 гепт короткой последовательности, содержащей сайт Ры 1. При двойном гидролизе Вц 11 и Яа 1, элюции, большого фрагмента и лигации с синтетическим полилинкером замещают короткую последователыость;56 АТС СА 6 СТ 6 АСАТСТ 6 САТ 6 С 6 6 ТС 6 АСТ 6 ТА 6 АС 6 ТАС 6 СА 6 СТи обладают липким концом ВдИ 1, липким концом Яа 1, а также сайтами рестрикции Рзт 1, ВдП и Яр 1.Полученный таким образом новый вектор обозначают рТ 61819. ДНК этого вектора гидролизуют ЯрЬ 1 и Ры 1. При двойном гидролизе получают три фрагмента: один Рзт 1 - Рзт 1 6,5 кв, один Рзт 1 - ЯрЬ 1,9 кв и другой Яр 1 - Рзт 1 0,5 кв Два более длинных фрагмента очищают и смешивают с фрагментом Ярц 1 - Рзт 1, соответствующим зрелому гирудину и происходящим из фага М 13 Т 61827, и получают вектор экспрессии: рТ 61828.П р и и е р 3. Частично обрабатывают ДНК рТ 6881 с помощью Рвт 1 и получают фрагмент 6,1 кв. Этот фрагмент изолируют, потом Гидролизуют Вд 111, высвобождают 210 20 35 50 фрагмента Рзт 1 - Рзт 1 и Рзт 1 - ВдП 1. Эти двафрагмента лигируют с фрагментом Рзт 1 -ВдИ 0,62 кв, из рТ 01828. Таким образомполучают новый вектор рТ 01833, которыйотличается от плазмиды рТ 6897 делециейпоследовательностей, кодирующей Оа -А 1 ац - А(а. Эта плазмида рТ 61833 имеетначало репликации для Е.со(1, ген устойчивости к ампициллину, генеа 2 Я.сегеч(з(ае,фрагмент плаэмиды 2 м, который обеспечивает репликацию в Я,сегеч(з 1 ае промотаргена МРа(рда 1, кодирующий пре-про, и генгирудина.П р и м е р 4. Трансформируют штаммЯ.сегеч(з 1 ае Т 0 У 1 зр 4/Мата рйа ига 3-251373-328 Ыз-15/ плаэмидами рТ 61818,рТ 61828 и рТ 61833. Результаты показывают, что рТ 61818 и рТ 01833 вызываютсекрецию гирудиновой активности на одинаковом уровне. Напротив, ТОУ 1 зр 4рТ 01828 секретирует в два раза меньшуюактивность гирудина, чем два других штамма. Также сравнивают синтез гирудина, секретируемого штаммами Я.сегеч(з(ае /Ма 1 а/Т 0 У 14-1, трансформированным илирТ 61828 или РТ 61833 и Т 0 У 14-2, трансформированными теми же плазмидами (табл.1-2). В случае штамма ТОУ 14-2 ,половойтип Мата(рЬа) плазмида рТ 61833 обеспечивает лучшую секрецию гирудина, чем плаэмида рТ 01828. Напротив, в случае штаммаТОУ 14-1 (половой тип Маса эЕП 1833 не вызывает секрецию гирудина, как ожидалось,тогда как И 614-2 продуцирует гирудин.П р и м е р 5. Из штамма Т 0 У 1 зр 4рТ 6833 выделяют спонтанные мутанты,. способные образовывать колонии на полной среде (УР 0), дополненной 1 мг/мл 5 фторурацила, 6 мутантов культивируот наполной среде и выбираот один, который необладает ни одной выжившей колонией дляплазмиды после более 20 генераций роста внеселективных условиях.Мутант, названный Т 6 У( зр 4-3, используют для продуцирования гирудина в полной среде,П р и м е р 6, Эта последовательностьнесет элементы слияния последовательности НЧ 1 с частью пре-про МРа 1 рЬа 1 и сигналами, обеспечивающими правильноевызревание секретированнага гирудина, вчастности, область соединения должна содержатьдублет Руз-Агд сразу выше первогооетатка й Нг-концевай 0 Ч 1,Синтез осуществляют иэ двух отдельных блоков, которые затем объединяют,Первый блок содержит 9 олигонуклеатидав,пронумерованных от 1 до 9, а второй блоксодержит 10 нуклеотидов, пронумерованных от 10 до 19..П р и м е р 7. Олигануклеотиды 2-8 фосфорилируат па их 5,-концам, чтобы избежать образование димеров или полимеров: 500 пикомолей каждого олигонуклеотида обрабатывают полицуклеотидкиназой 12 единицы) в конечном объеме 25 мкл Трис НС 60 мМ, рН 7,5, МдС 2 10 мМ, дитиотрейтал 8 мМ, содержащем З,З пмолей гамма-АТФ 32 р 500 кюри(нмаль), после 15 минут инкубации при 37 С прибавляют 5 нмолей цемеченай АТФ. После инкубации при 37 С в течение 30 минут комплементарцые фрагменты гибридизируют два ца два, эа исключением фрагментов 1, 2 и 3, эти последние смешийаат вместе. Используют 300 пмолей кахдага алигонуклеатида в конечном объеме 10 мюТрис НС 66 мМ, рН 7,5, МдС 2 6 мМ, МаС 100 мЫ, спермидин 0,5 мМ, ДТТ 8 мМ. Каждую смесь нагревают при 100 С в течение 3 мин, затем охлаждают медленно до 37 С в течение 2 ч. Гибридизираванье алигонуклеотиды 1-2-3 смешиваат с олигонуклеатидами 4-5 и инкубируют при 37 С в течение 2 ч: Таким же образом проводят гибридиэацио пар нуклеатидов 6-7 и 8-9. На последнем этапе объединяют 9 уклеатидов, предварительно обрабатаццых таким образам, их инкубируют 2 часа при 37 С в конечном объеме 100 мкл 14 пмолей этих гибридиэованных олигонуклеотидов подвергают обработке лигазой Т 4 в течение 15 часов при 15 С. Затем к реакционной смеси прибавляют 50 нг большого фрагмента 1-пг(11-Вагп Н 1 М 13 Т 0131, предварительно очищеннога на геле. Лигираванную смесь используют для трансформации клеток Е.соИ М 103, Среди 12 кланов полученных таким образом фагав один обладает искомой последовательностью: М 13 Т 61888,Испальзуат ту ке самую стратегию для синтеза второго блока, который клацируот между сайтами ОапН 1 и Яа(1 фага М 13 Т 6131. Два клана на 12 тестов имеот вставку, соатветствующуо искомой последовательности. Один из этих клонов назван Ы 13 Т 61889,Две двуниточные ДНК М 13 Т 01888 и М 1 ЗТ 01889 гидрализуют рестригаэали Нпб(1 и ВагпН 1 и Яа(1, смешивают с большим фрагментом Нпс 1 - Яа 1, очищенным на геле. Пигираоаную смесь подвергают трансформации Е.са 1106. После селекции на устойчивость к ампициллицу получают плаэмиду рТ 01890, которая содержит правлльна реконструираванную синтетическуа последовательность.П р и м е р 8, Нп 01 - ВШИ фрагмент ДНК рТ 01890 несет последовательность,1776276 10 Таблица 1 Антитромбиновая активность гирудина, секретируемого штаммами дрожжей Таблица 40 Антитромбиновая активность гирудина, секретируемого штаммами дрожжей кодирующую НЧ 1 (сайт Вц расположен сразу выше сайта Яа 1, который служит при предшествующем клонировании (для вставки между сайтами Нпс и В 9 плазмиды рТ 6881. В полученной плазмиде рТ 61891 ген РИ, последовательно, оказывается вставленным между последовательностями пре-про МЕарЬа 1 и терминатором транскрипции, Такая конструкция 1 обеспечивает созревание и секрецию гирудина НЧ 1, потому что она является идентичной рТ 61818, за исключением последовательностей, кодирующих НЧ 2, которые заменены последовательностями НЧ 1.П р и м е р.9. Штамм Т 6 У 1 зр 4 (ар 1 аога 3-251-373-373-328, Нб 3-11-15) трансформируют плазмидой рТ 61891, 2 клона полученных селекцией на ага+, культивируют и определя 1 от и родуцирование гирудина, секретированного в культуральную среду. В качестве контроля определяют в тех же условиях количество гирудина, секретированного И 6 У 1 зр 4 рТ 61818,Определяют в два раза большую антитромбиновую активность при поверхностном культивировании штамма Т 6 У 1 зр 4 рТ 618191 (0,9 мг/л поверхностной культуры), чем в культуре штамма Т 6 У 1 зр рТ 61833.Депонирование ш таммов-представителей изобретения.Следующие штаммы депонируют в Национальной коллекции Культур Микроорганизмов Института Пастера 16 июня 1986 года. ЯассЬагогпусез сегечзае Т 61 У зр 4рТ 61828 под М 1-569Зассйагопусез сегечзае Т 6 У 1 зр.ЗрТ 61833 под М 1-570 6 ноября 1986 года.5 Яассйэговусез сегечзае НТ 6 У 1 зр 4 рТ 61891 под В 1-623.Формула изобретенияСпособ получения полипептида со свойствами гирудина, предусматривающий10 конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей НИ или НЧ 2,трансформацию полученными ДНК штам- .мов Яэссйаговусез сегечзае, культивирование трансформированных дрожжей,15 выделение и очистку целевого продукта, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК рТ 61828, илирТ 61833, или рТ 61391, содержащие после 20 довательнастиЯтг -ех - Яс - ген Н,где Н - ген, кодирующий гирудин НИили НЧ 2;Ятг - представляет собой промотор гена25 Рбй-дрожжей;ех - последовательность, обеспечивающая секоецию полового феромона дрожжей;Зс - последовательность, кодирующаяЗС участок расщепления протеина, т.е. АТ 6 илидва кодона, кодирующихуз-Аг 9, или пятькодонов для Ясг -ео - Азр -уз - Агу.Приоритет по признакам;10.07.86 соответствует плазмидам35 рТ 61828 и рТ 61833, т.е, гирудину НЧ 2;01.12,86 - плазмиде рТ 61891, т,е. НЧ 1.