Способ диагностики гипертонической болезни

)4 61 В 1 Е ап 75 й болезни, 2 табл,е рови для вызвития гипереличение то ти диагностик крови е сыворот олуч минентрифлученнпри -2арата й вены,затем мин) и п а хранят ного преОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ(5) Изобретение относится к медицине, а именно к способам биохимического тестирования сыворотки крови. для ранней диагностики гипертонической болезни. Целью изобретениявляется увеличение точности спосовыявления больных гипертоническойболезнью на ранних стадиях ее развития. Эта цель достигается тем,что,Изобретение относится к медицине,а именно к способам биохимического естирования сывороткивления ранней стадиионической болезни.Цель изобретения -Кровь из локтево выдерживают при 4 С гируют (1500 д, 10 сыворотку до анализПолучение очищен Ба,К-АТФазы. кроме исследования действия сыворотки крови пациента на активностьИа,К-АТФаэы, с последующей оценкойстепени ингибирования, % (А), дополнительно проводят электрофорезсыворотки крови, определяют процентное содержание в ней белков с мол.мас.12 кД (В) и 15 кД(С), Затем расчитывают индекс риска (У) по Формуле 1 == 0,096 А + 0,6 В + 0,39 С - 8,31. Призначениях индекса риска ) -0,2 выяв.ляют гипертоническую болезнь, Прииспользовании предложенного способавероятность правильной классиФикации пациентов на людей с гипертонической болезнью и с нормальным артериальным давлением составляет 100%и на 40% увеличивается точность диагностирования по сравнению с известными способами эа счет испольэования в независимых друг от друга параметров, сопутствующих гипертоничесВ основу метода выдел ния Ма, К-АТФазы положен принцип, предложенный Хопкинсом, Для выделения используют солевые железы домашних уток, которым 10 дней вместо воды дают 0,2 М БаС 1. К 5 г измельченных желез добавляют 10-кратный объем среды выделения (0,25 М сахароза,20 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА; рН 7,4 при 40 С) и гомогениэируют ножевым гомогенизатором при 4500 об/мин 4 раза по 30 с с интервалами в 1 мин, Геогенат Фильтруют через 3 слоя марли и центриФугируют 15 мин при 5000 д.о Супернатант хранят при 4 С, а осадок3 1497575 р 1 суспендируют в 1 О мл среды выделенгя и центрифугируют в том же режиме. Затем супернатанты объединяют и центрифугируют 1 ч при 45000 я. Полученную микросомальную фракцию ресуспендируют в 2,5 мл среды выделенйя и обрабатывают ДДС-Яа по методу Йоргенсена, Микросомальный материал разводят в среде : 3 мМ АТФ, 2 мМ Э ТА, 20 мМ Трис (рН 7,4 при 250 С);, и каплям добавляют ДДС-Иа при пост янном перемешивании, при этом кон чная концентрация белка должна сост влять 1,4 мг/мл а содержание 15С-Ба 0,1 - 0,5 мг/мл. После стояя полученного раствора ЗО мин наомфгнитной мешалке при 25 С, его порцгями, по 3,5 м(, наслаивают на гра/д ент плотности еахароэы, составлен гпяй в центрифужных пробирках на Зб,мл: 13,5 мл 29 Х-ной, 8,0 мл 17.-ной и 5,0 мл 103-ной сахарозы, Ве растворы сахарозы готовят на буфере: 20 мМ Трис и 1 мИ ЭДТА (рН 7,4 25опри 4 С). После центрифугирования (10 мин, 105000 д при 4"С) осадки объединяют и суспендируют в 1,5 мл с 1 геды выделения. Полученный препарат Ба, К-АТФазы разливают по 100 мкм 30 впластмассовые пробирки и хранят п и -20 С не более 2 мес. Концентраоц белка в препарате, определяемая м тодом Лоури, составляет 1-3 мг/мл, аактивность Ма, К-АТФазы 1000 - 100 мкмоль Ф 7 мг белка в 1 ч, Фермфнтный препарат не содержит Мд-АТфазй. Определение степени ингибирова ноя Ма, К-АТФазы сывороткой краек. ф Активность фермента измеряют с 250 мкл сыворотки и без нее (250 мкл Н О) в 1 мл среды инкубации, мИ: БС 1 90; КС 1 60 МоС 13; АТФ 3; ийидазол 30:(рН 7,4 при 37 С). Реакцию гидролиза АТФ начинают добавлением ферментного препарата (1 О 20 мкг) и после 5-10 мин инкубации останавливают добавлением трихлоук 50 сусной кислоты до конечной концентрации 10 %. После осаждения белка (1200 8, 5 мин) в супернатанте измеряют содержаиие Ф 1 методом ФиекеСуббароу. Гтепень ингибирования активности Ыа, К-АТФазы рассчитывают в Ж как разницу между величинами активности фермента с (1007 ) и без сыворотки в среде инкубации. оОпределение содержания в сыворотке крови белков с мол.массой 12 и15 кД.Методом электрофоретического анализа сыворотки крови определяют содержание в ней низкомолекулярных белков (Х), используя соответствующиевеличины площадей пиков, полученныхпри сканировании электрофореграюына " Шггазсап 1 акег йепзЫоше 1 ег 2220" (1 кВ) при 550 нм,Предварительно сыворотку кровиразводят,в 20 раз раствором: 0,025 Ъ 1Трис-НС 1 (рН 6,8), 5 Е глицерин, 27ДДС-Иа, 2,5 Е р -меркаптоэтанол и нагревают при 80 Г 3 мин, Электрофорезв полиакриламидном геле проводят вприсутствии ДДС-Ма, используя прибордля вертикального электрофореза(Во - Най, 220). Процесс длится4 ч при постоянном токе 40 мА напластину. Окрашивание белковых полососуществляют 30 мин при 90 С в среде, 7. кумасси В0,25; изопропанол 20; уксусная кислота 7. От избытка красителя гель отмывают в смеси203 изопро(анола и 7 Е уксусной кислоты,Статистическую обработку данныхосуществляли, используя программы7 Д, 6 Ди 7 М из пакета программВМДП"для анализа биологическихи медицинских данных. Наибольшую вероятность правильной классиФикацииудалось получить только при использовании в пошаговом дискриминационном анализе комбинации всех трехизмеряемых параметров сыворотки крови, на основе чего выведено каноническое уравнение (1). Подставляя внего значения степени ингибированияБа, К-АТФазы сьвороткой крови и содержания в ней белков с мол,массой12 и 15 кД определяют индекс рискаданного пациента, при значениях которого ) -0,2 выявляют гипертоническую.болезнь.Способ опробован на группе пациентов (20 человек) в возрасте от 16до 46 лет, 10 из которых имели нормальное артериальное давление, а10 - страдали гипертонической бояезнью 1-11 стадий. Все пациенты втечение 2 недель до начала обследования не принимали гипотензивных ле-:карств. Пациенты контрольной группыимели систолическое артериальноедавление 4 140 мм рт.ст. и/или ди5 1497астолическое90 мм рт.ст. Диагнозгипертонической болезни ставился присистолическом давлении ) 160 мм рт.сти/или диастолическом95 мм рт.ст.,при отсутствии клинических данных,подтверждающих симптоматический характер повыщения артериального давления,П р и м е р 1. Определение индекса риска для пациента с гипертонической болезнью.Определяли степень ин 1 ибированияИа, К-АТФазы сывороткой крови.Реакцию ферментативного гидролиза АТФ 15проводили в двух центрифужных пробирках, содержащих по 1 мл среды инкубации. В одной находилось 250 мклсыворотки, а в другой 250 мкл НО.Реакцию начинали добавлением 1 5 мкг 20ферментного препарата, предварительно полученного иэ солевых железуток. После 5 мин инкубации при37 С реакцию останавливали добавлением трихлоруксусной кислоты (конечная концентрация 1 ОХ), сывороточныйбелок удалили центрифугированием(1200 д, 5 мин). В супернатантевыделили содержание Ф методом Фиске-Суббароу, измеряя оптическую плотность относительно контрольной пробы на фотоэлектрокаллориметре (Еа"при 650-660 нм в 5 мм кюветах, Вконтрольные пробы, содержащие либо250 мкл сыворотки, либо 250 мкл НО,препарат Иа, К-АТФазы после трихлоруксусной кислоты не добавляли. Активность Иа, Л-АТФаэы беэ сыворотки составляла 1200 мкмоль Ф/мг белка в 1 ч, а с ней - 240 мкмоль Фв/мг белка в 1 ч, что соответствует 80 Х-ному ингибированию фермента.Для определения содержания в сыворотке крови белков с мол,массой 12 и 15 кД проводили электрофорез образцов сыворотки крови в полиакриламидном геле в присутствии ДДС-Ба. аПроцентное содержание в сыворотке крови белка 12 кД составило 4,0 Х, а 15 кД белка 2,2 Х. Полученные величины подставляют в уравнение (1); У = 0,096 80 + 0,6 4,0 ++ 0,39 2,2-8,31 = 2,6.55Таким образом, У ) -0,2.П р и м е р 2, Определение индекса риска для пациента с нормальным уровнем артериального давления,575 бСтепень ингибирозания Ма, К-АТФазы сывороткой крови и содержание в ней 12 и 15 кД белковых компонентов определяли по примеру 1.Активность Иа, К-АТФазы беэ сыво-. ротки крови составляла 1200 мкмоль Фи/мг белка в 1 ч, а с ней 672 мкмоль Ф/мг белка в 1 ч, что составляет 59 Х от первой величины и соответствует 41 Х-ному ингибированию Иа, К-АТФазы. Содержание в сыворотке крови белков с мол.массой 12 и 15 кД составляло 2,0 и 1,5 Х соответс-.венно. Подставляя полученные величины в уравнение (1): У = 0,09641 + 0,62,0 ++ 0,39 1,5-8,39 = -2,6,получают У (-0,2.П р и м е р 3. Определение индекса риска при его пограничном значении для пациента с гипертоническойсболезнью,Степень ингибирования Иа, К-АТФазы сывороткой крови и содержание вней 12 и 15 кД белковых компонентов определяют по примеруАктивность Иа, К-АТФазы беэ сыворотки составляла 1200 мкмоль Фн/мгбелка в 1 ч, а с ней - 685 мкмольФ/мг белка в 1 ч, что соответствует 43 Х-ному ингибированию фермента.Содержание в сыворотке крови белковс мол,массой 12 и 15 кП составляло3,2 и 5,2 Х соответственно. Полученные величины подставляют в уравнение (1): У = 0;09643 + 0,6 3,2 ++ 0,395,2 - 8,31 = - 0,2. Приведенные примеры показывают, что предлагаемый способ диагностики гипертонической болезни позволяет выявить ранние стадии развитий болезни, не прибегая к длительным клиническим исследованиям. Биохимическое тестирование сыворотки крови может быть применено при массовых профилактических обследованиях пациентов. В среднем для группы больных характерны как более высокий уровень ингибирования сывороткой крови Ба, К-АТФазы, так и более высокое содержание в сыворотке белков с мол,мас- . сой 12 и 15 кД, а также их суммы (табл.,1). При высоком уровне досто. верности различий измеряемых парамет1497575 ров между группами (табл,2) наблюдан 1 тся значительные отклонения отсреднего, поэтому значения измеряемых параметров для контрольной иопытной групп существенно перекрываются. Таким образом, каждый из этихпараметров по отдельности не можетбысть использован для диагностики гипе тенэивного состояния. В то жевр мя корреляционный анализ показал,чт эти параметры не связаны междусо ой (табл,2). Методом пошаговогоди криминационного анализа показано,чт наилучших результатов, т.е.10 %-ную вероятность правильнойкл ссификации, удается получитьто ько при использовании всех трехпа аметров сыворотки крови,действия сыворотки крови пациентовна активность препарата Иа, К-АТфазыс последующей оценкой степени ингибирования фермента, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью увеличения точности способа, дополнительнопроводят элетрофорез сыворотки крови,определяют процентное. содержание вней белков с мол,массой 12 и 15 кД,затем рассчитывают индекс риска Упо формуле У = 0,096 А + 0,6 В + 0,39 С -Ж- 8,31, (1)где А - степень ингибирования Ба,К-АТфазы, %;В - содержание белков с мол.массой 1 2 кД,%;С - содержание белков с мол.массой 15 кД, %,и при значених индекса риска болееили равном -0,2 диагностируют гипертоническую болезнь,Формула из обретения,Способ диагностики гипертоническо болезни, включающий определение Т а б л и ц а 1 Сыворотка крови людей с гипертонической болезнью Сыворотка крови людей из контрольной группы одержание белка,% Индек риска 12 кД 15 кД1497575. Таблица 2 Содержание белковых компонентов, 7,1 ИнгибиГруппалюдей Варьирование рованиеЗЪфК АТф 12 кД 15 кД12 + 15 кД величин КонтрольнаяОпытная Составитель Н,Гуляева Техред П,Олийнык Корректор Л,Бескид Редактор Л.Пчолинская Заказ 4439/47 Тираж 789 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР: 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат"Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 МаксимумМинимумСреднееМаксимумМинимумСреднееРс 5,901,4 + 0,66,01,53,9+0,40,0026 3,601,6 ф 0,35,21,.22,810,40 0402 9,5 о 3,0 ф 0,4 9,8 4,8 6,7+0,40,016