Способ определения дефекта антигеннезависимой дифференцировки в-лимфоцитов

(51 )4 С 01 И 33/53 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Е госуддРственный номитктПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Читинский государственный медицинский институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕФЕКТА АНТИГЕННЕЗАВИСИМОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ВЛИМФОЦИТОВ(57) Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и може быть использовано для определения иммунного статуса организма. Целью изобретения является повышение точности за счет выявления нредшественников В-лимфоцитов, Для этого лимфоциты периферической крови обследуео мого инкубируют с пептидами из сумИзобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и может быть использовано для определения иммунологического состояния организма.Цель изобретения - повышение точности оценки дефекта антигеннезависимой дифференцировки В-лимфоцитов,Указанная пель достигается тем, что перед проведением реакции озеткообразования с эритроцитами,нагруженными антииммуноглобулинами,лимфоциты инкубируют в течение 1-8 ч в присутствии пептидов иэ сумки Фабри циуса (2,0-100 мкг/мл), а оценку.ЯО 1 975 А 1 2ки Фабрнциуса н концентрации 2 .100 мкг/мл в течение 1-о ч . Чатем осуществляют реакцию розеткообразавания с эритроцитами, нагруженными антииммуноглобулинами, Антииммуноглобулины против иммуноглобулинон человека "пришивают" с помощью хлористого хрома. Оценку нарушения антигеннезанисимой дифференцировки В-лимфоцитон осуществляют по увеличению лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами после инкубации с пептидами из сумки Фабрициуса по сравнению с контрольной пробой, в которой лимфоциты инкубируют в среде 199 без биологически активных соединений из сумки Фабрициуса. Увеличение числа таких лимфоцитон более 28,3% свидетельствует о нарушении иммунологического статуса. Предлагаемым способом выявлено нарушений у 90,5% больных в сравнении с 38,1% по способу-прототипу. осуществляют по увеличению количества лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами после инкубации. Так,при увеличении числа лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами более 28,3% диагностируют дефект антигеннезависимой дифференцировки В-лимФоцитов,ф Способ осуществляется следующим образом.ОсДля приготовления тест-зритроцитов используют поливалентную антисыворотку против всех иммуноглобулиион человека. Белковый преципитат из ан 3 .1 497Фисыворотки, полученный высаливаниемс помощью 33%-ного раствора сульфатааммония, растворяют в дистиллированной воде и диализуют против 0,0175 МФосфатного буфера, рН 6,3. Концентрацию белка определяют на спектрофотометре СФпри дпине волны280 нм. К 0,2 мл 50%-ной суспенэииЗритроцитов барана, отмытых три разаиэиологическим раствором, добавлят при комнатной температуре равныйбъем -глобулиновой фракции (содерание белка 3-5,мг/мл)К постоянноеремешиваемой взвеси добавляют,1 мл раствора хлористого хрома(0,25-0,01 мг/мл). После инкубафии в течение 5 минут клетки триждыотмывают эабуфереиным физиологичес"зим раствором (рН 7,3) и из них готовят 0,5 Х-ную суспенэию, Приготовлен".ые таким образом тест-эритроцитыранят при 4 фС в течение 1 недели.еред использованием после хранениятест-эритроциты отмывают однократносредой 199 или физиологическим раствором,Выделение лимфоцитов проводятСтандартным образом.Кровь больного собирают в пробирКи, куда предварительно был внесЕн.1 епарин (25 ед/мп крови). ЗатемКровь разводят в соотношении 1:3Изотоническим буферным раствором,наслаивают на смесь фикол-гипак плот, остью 1,077 г/мл и центрифугируюттечение 30-40 минут при 400 р.Соби"рают слой клетрк с интерфазногослоя и 3 раза отмывают средой 199,В суспензии отмытых лимфоцитов опре-,деляют количество клеток и доводятдо концентрации 2-4 х 10 клеток на4ф1 мл. Далее в 2 конические пробиркивносят по 0,1 мл взвеси лимфоцитови затем в первую пробирку добавляют0,1 мл среды 199, а во вторую 0,1 млсреды 199 с пептидами из сумки Фабрициуса в концентрации 4-200 мкг/мл.Обе пробирки помещают в термостати инкубируют при 37 С в течение 18 ч, Затем пробы один раз отмываютцентрифугированием при 200 Р. в течение 5 мин Физиологическим раствороми.взвешивают осадки клеток в объеме0,1 мл Физиологического раствора.Определяют в тесте с трипановым синим жизнеспособность клеток, котораядолжна быть не менее 95-97 Х. В обепробирки вносят эритроциты, сенсиби 574 4лизированные антииммуноглобулинами,объемом 0,1 мл 0,5 Х-.ной взвеси. Вэти же пробирки вносят по О,1 мл0,05 Х-ного раствора аэида натриядля блокады связыВания лимфоцитамиэритроцитов, обработанных иммуноглобулинами эа счет У -рецепторов.Смесь клеток инкубируют при 37"С втечение 15 мин, затем центрифугируют 5 мин при 500 об/мин и инкубируют 8-16 ч при 4 С, Затем осадок ресуспендируют осторожным встряхиванием и подсчитывают число розеткообразующих клеток (Х РОК). Просчитывают не менее 200 лимфоцитов. За РОКпринимают лимфоциты, присоединившие3 и более тест-эритроцитов, Увеличение числа РОК после инкубации опре деляют по формуле:А-ВСВгде С - Х увеличения числа розетко-, 25образующих клеток после ингкубации с пептидами из сумки Фабрициуса;А - число РОК во второй пробирке;В " число РОК в первой пробирке.оДля определения режимов инкубации используют кровь от больных свыраженными иммунодефицитами. Из крови в стандартных условиях способаполучают лимфоциты, которые инкубируют в течение 5,20,60,120,240,480,600 мин с пептидами из сумки Фабрициуса (концентрация 10 мкг/мл), Затем смешивают отмытые лимфоциты стест-эритроцитами и определяют число РОК.Зависимость процесса розеткообразовання лимфоцитов с эритроцитами,нагруженными антииммуноглобулинами,от времени инкубации представлена втабл.1. Контроль - это лимфоциты, инкубированные в среде 199 в течение 60 мин, такое время необходимо для того, чтобы адсорбированные цитофильные иммуноглобулины покинули лимфоциты и остались только истинные мембранные иммуноглобулины, которые синтезированы данной клеткой. При дальнейшей инкубацни (более 60 мин) число лимфоцитов не возрастает.Данные табл,1 показывают, что наиболее выраженный и достоверный эф497574 10 15 20 25 2. 30 35 40 45 50 5 1 Фект увеличения лимфоцитов с иммуыоглобулиновыми рецепторами наблюдают, если суспензию лимфоцитов инкубируют с пептидами из сумки Фабрициуса в течение 60-480 мин (1-8 ч). Если инкубация продолжается менее 1 ч или более Я ч, то увеличение лимфоци тов с иммуноглобулиновыми рецепторами недостоверно.Зависимость влияния концентрации пептидов иэ сумки Фабрициуса в инкубационной среде представлена в табл.Лимфоциты получают и готовят тест эритроциты в стандартных условиях способа. Данные табл.2 показывают, чтонаиболее выраженный эффект на розеткообразование оказывают пептиды изсумки Фабрициуса в концентрации2,0-100,0 мкг/мл среды 199. При других концентрациях пептидов наблюдаются недостоверные показатели,Таким образом, только инкубациейлимфоцитов с пептидами из сумки Фабрициуса в концентрации 2,0100,0 мкг/мл в течение 1-8 ч обеспечивается наиболее оптимальное влияние на рецепторный аппарат В-лимфоцитов: иммуноглобулиновые рецепторы,Был проведен сравнительный анализ группы здоровых доноров (25 человек) и группы больных (21 человек),При осуществлении предлагаемогочспособа,было установлено, что у здоровых людей после инкубации лимфоцитов с пептидами из сумки Фабрициусаувеличивается количество розеток сэритроцитами, нагруженными антииммуноглобулинами на 12,311,3 Х (М+м),а у больных - на 44,8+7,5% (Мйм),При сравнении результатов достоверность различий в данных группах составила Р ( 0,01, что свидетельствуето том, что в группе больных по сравнению со здоровыми людьми выявляется большее количество незрелых формВ-клеток.Данные по апробации способа набольных с ожогами 2-3 степени (11больных), отморожениями. 2-4 степени(4 больных), абсцессом дугласовапространства (1 больной) представлены в табл.З,Данные табл.З показывают, чтоизвестным способом выявляют нарушения иммунного статуса у 38,13 больпых ,по сравнении с нормальными показателями 20-302, прецлагаемымспособом - у 90,5 Х больных (с учетом того, что у здоровых больных увеличение лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами происходит до20 Я). Предлагаемый спОс 06 позВОлил Выявить дополнительную группу больных (52,4 Е) с нарушениями иммунологического статуса, а также установить причину этих нарушений, связанную с тем,что нарушается антиген независимая дифференцировка В-лимфоцитов. Это позволило в дальнейшем назначить коррегирующее эти сдвиги лечение.Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет повысить эффективность контроля иммунологического статуса больного в сравнении с известным способом на 52,4 Х.Применение предлагаемого способа позволяет оценить состояние дифференцировки В-лимфоцитов не по абсолютной величине ПАРР в суспензии лимфоцитов периферической крови, а по характеру приращения, исключив иэ рассмотрения фоновую составляющую ПАРР.П р и м е р 1, Больной М 29 лет. Диагноз: ожог 11-111 степени 243 поверхности тела, Способом-прототипом установлено количество лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами 227, т.е. в пределах нормы, После инкубации с пептидами иэ сумки Фабрициуса в стандартных условиях способа процент РОК повысился до 387. Увеличение количества лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами произошло на 72,77., что свидетельствует о нарушении в иммунологическом статусе, а именно о нарушении антигеннеэависимой дифференцировки В-лимфоцитов.П р и м е р 2, Больной В., 39 лет. Диагноз; разлитой гнойный перитонит, Способом прототипом установлено,что количество В-лимфоцитов равно20 Х, т.е. в пределах нормы, Послеинкубации лимфоцитов с пептидами изсумки Фабрициуса процент РОК повысился до 34 Х. Увеличение количества лимфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами произошло на 70 Х, что свидетельствует о большом содержанйи предшественников В-клеток и о нарушении дифференцировки В-лимфоцитов.В1497574 реальнейшем была осуществлена коррекция этих нарушений,Формула изобретения Способ определения дефекта антигеннезависимой дифференцировки В-лимфоцитов путем добавления к лимфоциам периферической крови больного ест-эритроцитов, нагруженных антимуноглобулинами, с последующим подТ а б л и ц а 1 Показатели Контроль Лимфоциты, инкубированные с пептидами из сумки Фабрициуса, в течение мин 1 5 20 60 120 240 480 600 21,1 2,04 26,7 1,37 26,5 1,08 достоверные величины по отношению к контролю. Т а блица 2 Лимфоциты, инкубированные с пептидами изсумки Фабрициуса, при концентрации мкг Показатели КонтрольОэ 1 Оэ 5 2 вО 10 фО 100 в 0 500 эО 21,5 22,9 26,7 30,9+ 32,9 30,5 24,7 2,04 2,04 1,08 1,37 2,43 1,69 2,04достоверные результаты по сравнению с контролем,Лимфоциты с новерхностными иммуно глобулинами,п=10 М Лимфоциты с поверхностными иммуно- глобулинаЕйИ п=10м счетом розеткообразующих лимфоцитов,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения точности способа, 5перед добавлением тест-эритроцитовлимфоциты инкубируют в ечение 1-8 чв присутствии 2-100 мкг/мл пептидовиз сумки Фабрициуса и при значенииколичества розеткообразующих лимфоцитов свыше 23,83 определяют нарушениеантигеннезависимой дифференцировкиВ-лимфоцитов. Ф 31,1 32,4 ф 33,6 32,5 27,6 1,08 1,69 2,04 1,08 1,371497574 Т а б л и ц а 3 Лимфоциты после инкубации Показатели в среде 199(прототип) с пептидамииз сумкиФабрициуса 221+1,5 32,0+1,98 16-153 38,1 90,5 Составитель Н,КалининТехред Л.Олийнык Корректор М.Максимишинец Редактор Л.Пчолинская Заказ 4439/47 Тираж 789 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,Ужгород, ул. Гагарина,101 РОК с эритроцитами,нагруженными анти- иммуноглобулинами, Х Нарушения им- мунологического статуса, Х Увеличениечисла РОКпосле инкубации с пептидами из сумки Фабрициуса,7