Реагент для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК А 72 04 С 12 Я 1/00 12 11 9/ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМ ЕТЕЛЬСТ 2 етат нат нат ия, цитр 0,9-1,5 0 8-1 2 мало идролизат каелатин 0,8 ий 0,04-0,06,р рН 5,4-5,6 нат натрия) зеина сухой 2,0; бромтим забуференныи остальное,Для получ ют в физраст ловый си физраств ие чувр ед елеалона 1 анта растворяорганической ения реаг воре соль чаетсяубстрататин ат на ы (ацетат натри алонат натрия),ем добавляю кисл идролизат к растворы жесинего, по зеина, затлатина и б тимолово ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Кишиневский государственныймедицинский институт(56) Авторское свидетельство СССР1364636, клС 12 11 1/00, 1986Андреева З,И. и др, Система индикаторная бумажная для ицентификацииэнтеробактерий. )Ю 43 И, 1983,4,стр. 20-23,(54) РЕАГЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЦЕТАТАЗЬ 1, ЦИТРАТАЗЫ И МАЛОНАТАЗЫ МИКРОБОВ(57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к реагентам дляопределения ферментативной активности микробов. С целью повышения чувствительности реагента для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов, последний помимо субстрата - натриевой соли органической Изобретение относится к микробиологии, а именно к реагентам для опрделения ферментативной активностимикробов,Цель изобретения - повьппенствительности реагента для опния ацетатазы, цитратазы и мзы микробов,Сущность изобретения заклюв том, что реагент содержит сгидролизат казеина сухой, желфизраствор и бромтимоловый синий прследующем соотношении компонентов. кислоты, индикатора - бромтимоловогосинего и забуференного физраствора срН 5,4-5,6, дополнительно содержитсухой гидролизат казеина и желатиныпри следующем соотношении компонентов, мас.7.: субстрат 0,9-1,5; сухойгидролизат казеина 0,8-1,2; желатин0,8-2,0; бромтимоловый синий 0,040,06; забуференный физраствор срН 5,4-5,6 - остальное, Реагентобладает повышенной чувствительностьюи позволяет определить соответствующую активность микробов при концентрациях 10-100 микробных клеток в 1 млв течение 7-9 ч, а при концентрацияхболее 1 млрд/мл - в течение 2-5 ч.Реагент предназначен для биохимической дифференциации микробов кишечногосемейства и удобен в походно-нолевыхусловиях, т.к. его использование может исключать этап накопления чистой культуры, что ведет к уменьшению срков получения результатов анализа.7 табл,мас.7.: соль органическои кислот50 П р и м е, р 1,.Из листа бумаги с полимерной пленкой вырезают диск диаметром 10 см. На пленочной поверхности расчерчивают 3 ряда по 5 зон площадью, 2,0 х 1,5 см (1 ряд зон для реагентов на ацетатазу, 2 ряд - на цитратазу, 3 ряд - на малонатазу). В 1 пробирку берут навеску порошков ацетата ченную смесь реактивов наносят на - гидрофобную поверхность полимерной пленки в виде капель, которые полимеризуются высушиванием при комнат 5 ной температуре. Соль органической кислоты (ацетат натрия, цитрат натрия, малонат натрия) вводят в реагент в качестве специфического субстрата, бромтимоловый синий играет роль индикатора рН реакции, указываюший на образование щелочных продуктов при ферментации субстрата ферментом микробов. Желатин способствует фиксации компонентов реагента к гидрофобной поверхности полимерной1пленки и одновременно вместе с гидролизатом казеина и субстратом служат питательными веществами для микробов, Это приводит к росту и размно жению микробов, а следовательно, при наличии у последних специфических ферментов (ацетатазы, цитратазы, малонатазы), к увеличиванию их количества (массы), что способствует ус корению ферментации субстратов и повышению чувствительности реагента. Это дает возможность определить ацетатазу, цитратазу и малонатазу 10- ,100 микробных клеток в 1 мл в тече- ние 7-9 ч, Бумага с гидрофобным полимерным покрытием служит носителем реагентов. Это создает возможность контакта микробной культуры с реагентом в микрокаплях, приводит к быстрому растворению ингредиентов и ферментации субстратов соответствующими ферментами микробов,В табл,1 представлена чувствитель" ность реагента для определения ацета. 40 тазы, цитратазы и малонатазы микробов.Реагенты, содержащие ингредиенты вне пределах граничных значений, имеют более низкую чувствительность, 45В табл,2 представлена чувствительность реагента для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов в зависимости отколичественных соотношений ингредиентов. натрия 0,1 г и гидролизата казеина сухого 0,1 г, во 2 пробирку - цитрата натрия 0,1 г и гидролизата казеина сухого 0,1 г в 3 пробирку - малоната натрия 0,1 г и гидролизата казеина сухого 0,1 г. Параллельно готовят растворы желатина и бромтимолового синего, Для приготовления раствора желатина 103-ного в 4 пробирку вносят навеску желатина пищевого (ГОСТ 11293-78) (1,0 г) и заливают дистиллированной водой (9,0 мл), выдерживают 60 мин, нагревают, не доводя докипения, при непрерывном помешивании стекляной палочкой до полного растворения, Для приготовления раствора бромтимолового синего 0,5 Е-ного в 5 пробирку вносят навеску порошка бромтимолового синего водорастворимого (ТУ 6-09-2045-77) (О, 05 г) и залиВают дистиллированной водой(10,0 мл), встряхивают до полного растворения, Затем в 1; 2, 3 пробирки вносят растворы желатина 103-ногои бромтииолового синего 0,57. по1,0 мл и забуференного физрастворарН 5,4-5,6 по 7,8 мл. Пробирки сосмесямиингредиентов помещают на водяной бане при 80 С, Полученные растворы охлаждают до комнатной температуры, после чего их наносят по 1 капле объема 0,02 мл в центр каждой зоны соответствующего ряда диска (раствор с ацетатом натрия из 1 пробирки наносят в зоны 1 ряда, раствор с цитратом натрия из 2 пробирки - в зоны 2 ряда и раствор с малонатом натрия из 3 пробирки - в зоны 3 ряда). После этого, диск оставляют при комнатной температуре до полного высыхания капель и получения фиксированных микропленочных реагентов,Готовые реагенты хранят в полиэтиленовых мешочках при комнатной температуре. По мере надобности реагенты используют для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов, С этой целью диск помещают в чашку Петри, а на поверхность реагентов наносят по 1 капле изучаемой микробнойкультуры, содержащей от 10-100 клеток и более в 1 мл физраствора рН 6,5, При этом, можно изучить какмикробную культуру со скошенного агара, так и колонию, Чашку закрывают и инокубируют при 37 С. При положительной06 Формула и э о б р е т е н и я15 0,8 - 1,2 0,8-2,0 Остальное ТаблицаСубстрат и время его фервяеитации 6 Ч аоличесво микровык клеток в ТТ 1 ТТ Г.ГТЛ 1 лонат натрия 3 4 5 6 3 16 9 1 2 3 4 56 3 8 9 М 2 3.4 5 Г 613 8 9+ П р и и е ч а и и е.Реакция лолояительиая, + реакцияотрицательная,ололокительная, - реа 514725реакции, как результат ферментацииацетата натрия, цитрата натрия илималоната натрия, цвет капли переходитиз желтого в синий,а при отрицательной реакции остается без изменений,П р и м е р 2. В табл.5, 6, 7представлены результаты испытанияпредложенного реагента для конкретных штаммов микроорганизмов, 1 ОВ табл.З дана чувствительность реагента и системы индикаторной бумажной с цитратом натрия,Чувствительность реагента и системы индикаторной бумажной с малонатомнатрия представлена в табл,4,Рэеидопюпаэ егир 1 поза АТСС 278533С 1 гоЪас 1;ег йгеппс 11 120001, Х 1 еЬз 1 е 1 -1 а рпеипюпдае 180104 - продуцентов ацетатазы, малонатазы и цитратаэы, показывающие более выгодную чувствительность реагента по сравнению с известным,Реагент для определения ацетатазы, 25цитратазы и малонатазы микробов позволяет определить ацетатазную активность, цитратазную активность и малонатазную активность микробов приконцентрациях от 10-100 микробных ЗОклеток в 1 мл в течение 7-9 ч, а приконцентрациях более 1 млрд/мл - 4 в течение 2-5 ч.Предлагаемый реагент предназначендля ускоренного определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы при биохимической дифференциации микробов кишечного семейства и других, и обладает значительно повышенной чувствительностью, Кроме того, реагентболее удобен для применения в лабораторной практике, особенно, в походно-полевых условиях и при массовыхисследованиях, так как его использование может исключать этап накопления чистой культуры, а следовательно,и уменьшаются сроки получения результатов анализа. Рвагент для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов, включающий субстрат - натриевую соль органической кислоты, эабуференный физраствор с рН 5,4-5,6, и индикатор - бромтимоловый синий, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности, он дополнительно содержит сухой гидролизат ка-. зеина и желатин при следующем соотношении компонентов, мас,Е:Натриевая сольорганическойкислоты 0,9-1,5Сухой гидролизат казеинаЖелатинБромтимоловыйсиний О, 04-0, 06Забуференныйфизрастворс рН 5,4-5,61472506 Таблица 2 интенсивность реакции ферментацииентрация микробов ат 8 ромтимлевыйсиний ццроливат ка ина сухойблиц Концентрация миФробов в 1 мл иколичество испы увствительность атистическиеказатели них положительных таиных культурферментирующихцитрат натрия системо реагентом Е +ш33,3+7,33,3+7,е, Результаты ферментации натрия учоинкубации при 37 С,Прим сь через ыв а 4 Концентрация микробов в 1 мл и коливительность, Статистически показатели з них положительных испытанных ферментиест культурующихрия системой алонат агента бс. Рш+П0 О, 001 0,.001 0 00100,0+0,0 100,0+0,0 100 О+О О, 100, О+0,0 100,0+0,0 100, О+О, 0 100, О+О, 0 100,0+0,0 100,0+0,0 100,0+0,0 0,001 0,001 О, 001 О, 001 0,001 0 0 0 13 0 0 13 100, О+ 13 100,0+ 0,0 0,0 3 езультаты ферментации малоната натрия учитывалисоерез 9 ч инкубации при 37 С,а ни Ь 07 ОУ В 08 08 1 Оъ 9 0 Ф 2 0,9 0,9 3 1,0 1,0 4 1,2 1,2 5 1,5 1,5 В 16 16 Г 1,7 1,7 1 О /45 10 /45 10 /45 10 /45 10 /45 10 /45 10 /45 1 О /1310 /131 О /1310 /1310 /131-0 /1310 /13108 /1310 /135 х 10 93,3+Зэ 7 93,3+ 3,7 93,3+3,7 95,5+3, 97 ф 7 2 т 2 100,00,0 100,0+0,0 100,0+0,0 100,0+0,0 100,0+0,002 Оь 02 ,03 0,03 ,04 0,04,045 0,045,05 0,051055 0055,06 0,06э 065 0,065 ,07 0,07 25,7 25,7 30,8 44,4 0 о,оо О,ОО О,ОО 0,001 о,оо о,оо О,ОО о,оо 0,001 о,оо10 1472506 Таблица 5 ао Скорость ферментацин ацетата натрия Система индикаторная бумакная Геагент ток+Ф Таблица 6 Концентрациямикробных кле орость ферментацни цитрата натрия я бумах Система нндикат Реаген 4 ч 5 ток а+ Таблица 7 Скорост онцентментацни малона натри раци Реагент1 ч 2 ч 3 ч 4 ч нкробых клеок вмл Система нндн1 ч ч 3 ч 4 ч торная бумакна ч+ +Составитель В,СоинаСегляник Техред Л.Сердюкова Коррект Романенко едакт Зак внии 1674/28 Тираж 501 Государственного комитет113035, Москва Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 101010 У10 Я101(1 к1 О1010З 10 ф Подписноепо изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС