Способ иммобилизации ферментов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 147250 9) 111 12 Б 11/1 И НИЕ ИЗОБРЕТЕОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ П Н АВТОРС мед ид Изобр логии, аческогоществ рапроисхожд ение и.гидивае ещи итанаТитехани дельн,06-0 енную вая губка имеет высок е иваольшуютавляющую ость,ть, соневысо ескую пр ую поверх 11 м /г, массу в циеигуб 3-5) ую насы,7-1,1 г/см,9ел ГОСУДАРСТВЕННЫИ НОМИПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТПРИ ГКНТ СССР(71) Одесский технологический инстут пищевой промышленностиим. М.В.Ломоносова(56) Иммобилизованные ферменты./Пред, Березина И,В Антонова В,КМартинека К. Изд-во МГУ, 1976,Авторское свидетельство СССРН 536192, кл. А 61 К 37/48, 1975. тение относится к биотехноименно к технологии биохимиревращения органических ветительного или животногоения, и может найти примеедицинской, химической и микробиологическои промышленностЦель изобретения - повышениеродинамической устойчивости привмых ферментов, упрощение и ускорние процесса иммобилизации,Способ осуществляется следуюобразом,К промытой в дистиллированноии высушенной титановой губке прилют перекись водорода с концентра30-357 при соотношении титановаяка: перекись водорода равном 1:) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ ) Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение вицинской, химической и микробиологической промышленности. Целью изобретения является повышение гидродинамической устойчивости прививае мых ферментов, упрощение и ускорение процесса. Согласно способу титановую губку, промытую водой и высушенную при 100 С, активируют путем обработоки перекисью водорода с концентрацией 30-357 при соотношении титановая губка: перекись водорода 1:(3-5) в .течение 45 мин при 55-67 С, после чего на активированный таким образом носитель иммобилизуют фермент извест ным способом. 1 з.п. ф-лы. 1 табл. соответственно, Смесь термостатируютпри 55-67 ОС при встряхивании в тече йЬние 45 мин, затем промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции и сушат при 150 С в течение 1 ч.Активированную таким образом титаноовую губку охлаждают до 0-4 С, послечего иммобилизуют на ней фермент,Титановая губка является побочным продуктом при получении чистого титана методом магнийтермическоговосстановления четыреххлористогоЪ, з 147250П р и м е р 1. Получение активированного носителя,К 5 г промытой в дистиллированной воде и высушенной при 100 С титановой губки добавляют 15 мл перекисиводорода с концентрацией 30-357Смесь термостатируют при 55 С привстряхивании в течение 45 мин, затем промывают дистиллированной водойдо нейтральной реакции и сушат при150 С в течение 1 ч, Активированную,таким образом титановую губку охлажодают до 0 С и используют для иммобилизации Ферментов, 15П р и м е р 2. Иммобилизация пепсина.К 2 г титановой губки, активированной по примеру 1, приливают 10 мл0,57.-ного раствора пепсина в 0,1 М 20ацетатном буфере при рН 4,0, Смесьвзбалтывают на механической качалкеов течение 1 ч при 4 С и выдерживаютв течение 10 ч. Титановую губку симмобилиэованными Ферментами промывают от несвязанного фермента 490 млдистиллированной воды, Получают иммобилизованный препарат с активностью1800 ед/г, т.е. 627. активности нативного фермента, ЗОП р и м е р 3. Иммобилизация пектиназы иэ Азрегц 111 из пЦег,К 2 г титановой губки, активированной по примеру 1, приливают 5 мл37.-ного раствора пектиназы в 0,1 Мацетатном буфере при рН 4,0, Смесь35тщательно перемешивают и взбалтывают на механической качалке 2 ч. прио0 С и оставляют на 10 ч. Губку промы;,вают 100 мл дистиллированной воды донейтральной реакции. Получают иммобилизованный препарат с активностьюФермента 83,2 ед/г, что составляет907 от активности нативного фермента.П р и м е р 4. Иммобилизация протеазы из Азрег 8 г 11 пз огукае.К 5 г титановой губки, активированной по примеру 1, приливают 10 мл0,57-ного раствора проторизина в0,1 М универсальном буферном растворе при рН 4 (О, М борной кислоты,0,1 М фосфорной кислоты, 0,1 М уксусной кислоты в 1 М щелочи). Смесь тщательно перемешивают и взбалтываютбна механической качалке 2 ч при 2 Си оставляют при этой температуре на10 ч, Титановую губку промывают100 мл дистиллированной воды до нейтральной среды, Получают иммобилизованный препарат с активностью фермента 132 ед/г, что составляет 667 от активности титанативного фермента.П р и м е р 5, Иммобилизация суспензий клеток Е.со 11.В качестве ферментативно активного материала используют суспензию клеток Е.со 1 г с аспартаэной активностью. Клетки Е,со 11 отделяют из культуральной среды и промывают дистиллированной водой с последующим центрифугированием в течение 10 мин, К 2 г титановой губки, активированной по примеру 1, приливают 10 мл суспензии клеток Е.со 11. Смесь охолаждают до 6-8 С, приливают 9 мл 0,1 М фосфатного буфера при рН 8,0, Смесь тщательно перемешивают и взбалтывают на механической качалке 2 ч при 4 С и оставляеют на 10 ч. Тита- новую губку с иммобилизованной суспензией клеток промывают на Фильтре от несвязанных клеток 0,1 М водным раствором хлористого натрия до ис- . чезновения светопоглощения при 280 нм в промывных водах и 0,1 М ацетатном буфере при рН 4,5 до отсутствия ионов хлора, Получают препарат с общей аспартаэной активностью 69520 ед, что составляет 907. от исходной общей аспартазной активности внесенных свободных клеток.П р и м е р б. Получение активи -рованного носителя фермента.К 5 г промытой в дистиллированнойоводе, а затем высушенной при 100 Ститановой губки добавляют 25 мл концентрированной гидроперекиси. Смесьотермостатируют при 67 С при встряхивании в течение 45 мин, затем промывают дистиллированной водой до нейторальной реакции и сушат при 150 Св течение 1 ч, Активированную такимобразом титановую губку охлаждают доО С. Подготовленную активированнуютитановую губку используют для иммобилизации на ней ферментов,П р и м е р 7, Иммобилизация пепсина,К 2 г титановой губки, активированной по примеру 6, приливают 10 мл0,5%-ного раствора пепсина в 0,1 Мацетатном буфере при рН 4,0, Смесьвзбалтывают на механической качалкев течение 1 ч при 4 С и выдерживаютв течение 10 ч, Титановую губку с иммента,Активность фермента, ед/г Гидролитическаяустойчи- вость Темпера- Время актура, С тивацииносиОбщеевремяактивапо примерам шение Т 1:Н 0 теля, мин ции 13711240104112 1 ч,45 1 ч,30 2 ч.1 ч.45. 6 6 6 45 42 60 55 6560,7065 1:2 1;6 1:2 1:6 11 12 13 14 Пеп сииПепсинПротеазаПротеаза,5 14мобилизованными ферментами промываютот несвязанного фермента 490 мл дистиллированной воды, Получают иммобилизованный препарат с активностью1870 ед/г, т.е. 64,4 Е активности нативного препарата,П р и м е р 8, Иммобилизация протеазы из Азрегд 11 цз огугае,К 5 г титановой губки, активированной по примеру 6, приливают 10 мл0,57-ного раствора проторизина в0,1 М универсальном буфере растворепри рН 4, Смесь тщательно перемешивают и взбалтывают на механическойокачалке 2 ч при 2 С и оставляют приэтой температуре на 10 ч, Титановуюгубку промывают 100 мл дистиллированной воды до нейтральной среды, Получают иммобилизованный препарат с активностью фермента 140 ед/г, что составляет 707 от активности нативногофермента.П р и м е р 9, Получение активированного носителя фермента,К 5 г промытой в дистиллированнойводе, а затем высушенной при 100 Ститановой губки добавляют 20 мл концентрированной гидроперекиси. Смесьтермостатируют при 60 С при встряхивании в течение 45 мин затем промывают дистиллированной водой до нейт.оральной реакции и сушат при 150 С втечение 1 ч. Активированную таким образом титановую губку охлаждают до,о0 С, Подготовленную активированнуютитановую губку используют для иммобилизации на ней ферментов.П р и м е р 10, Иммобилизацияпепсина.К 2 г титановой губки, активированной по примеру 9, приливают 10 мл0,5 Е-ного раствора пепсина в 0,1 Мацетатном буфере при рН 4,0, Смесьвзбалтывают на механической качалке Способ фермент Соотно 725056ов течение 1 ч при 4 С и выдерживаютв течение 10 ч. Титановую губку симмобилизованными ферментами проМыва -ют от несвязанного Фермента 490 млдистиллированной воды, Получают иммобилизованный препарат с активностью1780 ед/г, т.е, 61,57. активности нативного фермента,П р и м е р ы 11-18, Способ осу". ществляют аналогично, но при различном соотношении титановой губки и гидроперекиси при активации носителя,Результаты указаны в таблице.Как видно из таблицы при выходева режимы соотношения титановая20 губка:перекись водорода снижаетсяактивность иммобилизованного ФерФормула изобретения25 1, Способ иммобилизации Ферментов, предусматривающий активациюносителя на основе титана и последующее связывание ферментов с активиро ванным носителем, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью повышения гидродинамической устойчивости прививаемых ферментов, упрощения и ускорения процесса, в качестве носителя используют титановуюгубку, а активацию осуществляют путем обработки 30-353-ной перекисьюводорода при соотношении титановаягубка : перекись водорода равном 40 1:(3-5) соответственно и температуре 55-67 С,2. Способ по п. 1, о т л и ч а.ющ и й с я тем, что обработку перекисью водорода ведут в течение 45 45 мин .Заказ 1674/28 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул, Гагарина,10 16 17 18 Пектиназа . 12. Пектиназа 1:6 . Е.со 1 1:2 Е.со 11. 1:6 75 70 65 70 90 80 45 50 10 10 13 13 2 ч,302 ч.1,ч.451 ч. 30 67705130047900