Способ получения эндонуклеазы рестрикции fок1 из flаvовастеriuм океаnокоiтеs

(С 12 ЗОБРЕТЕНИЯЕТЕЛЬСТВУ ПИСАНИ ТОРСКОМУ СВИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОбРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫРЕСТРИКЦИИ РОК 1 ИЗ РЬАЧОВАСТЕК 113 МОКЕАБОК 01 ТЕБ(57) Изобретение относится к микробиологии, в частности к способу получения рестриктаз. Целью изобретения является повышение выхода ректриктазы РоЕ 1, Для этого штамм-продуцент Р 1 ачоЬасегдцш оЕеапо 1 осевВкультивируют на жидкой питательной среде, содержащей, г/л: пелтон 9,0-11,0; дрожжевой экстракт4,0-6,0; НаС 1 25,0-30,0; КС 1 0,51,0; .СаС 1 6 Н,20 2,0-3,0; МАЗО 7 НО6,0-7,5; глюкоза 0,5-1,5, до достижения стационарной фазы роста с последующим выделением и очисткой рестриктазы, включающей 3 хроматографические стадии. Способ позволяет увеличить выход фермента в 8-10 раз,.Выход фермента 2000 ед, на 1 г биомассы, активность препарата3000 ед./мл, 1 табл.Изобретение относится к микробиологии и касается способа полученияферментов нуклеинового обмена, в частности рестриктаз.Целью изобретения является повышение выхода фермента.Способ заключается в том, чтоштамм Р.оЕеапо 1 оез выращивают нажидкой среде следующего состава,г/л:Пептон 9,0 - 11,0Дрожжевойэкстракт 4 вО бфОЮаС 1 25,0 - 30,0КС 1 0,5 - 1,0 15СаС 1 6 НО 2,0 - 3,0МАМБО 7 НО 6,0 - 7,5Глюкоза 0,5 - 1,5рн 7,2,культивирование проводят при 27-29 С, 20до стационарной фазы роста, что соответствует оптической плотности 2,22,6 о.е. при В =550 нМ. Клетки разрушают ультразвуком и целевой продуктполучают последовательной хроматографической очисткой на фосфоцеллюлозеР, бензил-ДЕАЕ-целлюлозе и Фосфоцеллюлозе В.Культивирование бактерий на среде,имеющей сбалансированный состав солей, и при оптимальной температуре27-29 С приводит не к увеличению выхода биомассы, а к ее обогащениюименно ферментом рестрикции и повышению выхода целевого продукта в 8- 10раз по сравнению с известным способом. Выбор температуры культивированияобусловлен следующими экспериментальными фактами: изменение на 4-5 С волюбую сторону от оптимального интервала (27-29 С) уменьшает скоростьроста Р.о 1 еапоо 1 Тез в 2 раза и непозволяет получить более высокий выход фермента.Результаты экспериментов по подбору компонентов питательной среды длякультивирования Р.океапо 1 о 11 ез пред-,ставлены в таблице,Наиболее оптимальной и сбалансированной по составу солей являетсясреда 15.Выход Фермента в логарифмическойфазе роста повышается в 1,1-1,2 разапо сравнению со стационарной фазой,55однако полученный препарат ферментане стабилен при хранении (50% инактивация за 1 неделю). Установлено, что для получения стабильного при хранении препарата фермента сбор урожая бактерий наиболее технологично производить на стадии стационарной фазы роста.П р и м е р. Получение рестриктазы Рок 1.Культивирование Р.океапоодез.При культивированииклеток используют химреактивы отечественного производства без дополнительной очистки.Для выращивания бактерий готовят растворы питательной среды.Раствор 1: Пептон 10 гДрожжевойэкстракт 5 гИаС 1 27 гКС 1 0,7 гВода 900 мл Раствор кипятят 5 мин, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через фильтровальную бумагу, доводят рН до 7,2 с помощью 5 н, раствора ИаОН.Раствор 2; МАМБО 7 НО 7 гВода 50 млРаствор 3: СаС 1 6 НО 2,2 гВода 40 млРаствор 4; Глюкоза 1 гВода 10 млВсе растворы стерилизуют в автоклаве при 121 С 40 мин, затем сливаютов стерильных условиях непосредственно перед приготовлением питательной среды.Клетки бактерий подращивают на твердой питательной среде при 28 С в течение суток, затем готовят инокулят для засева ферментера. Объем инокулята 1/10 часть от объема Ферментера. Культивирование проводят в феро ментере (объем 20 л) при 28 С и аэрации 20 л/ч. Величина рН в процессе роста поддерживается автоматически на уровне 7,2 добавлением 0,2 н, ИаОН.Клетки выращивают до стационарной .фазы (оптическая плотность 2,5 при =550 нм). Клетки собирают центрифугированием при 5000 х 8 в течение 10 мин. Выход биомассы 3,5 г/л.Выделение и очистка рестриктазы.Все процедуры по выделению и очистке фермента проводят при 0 - 4 С.4 г клеток суспендируют в 20 мл 0,01 М трис-НС 1 буфера, рН 7,5, содержащего 0,1 тритона Х, разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе 4 раза по 40 с, клеточный дебрис отделяют140 центрифугированием при 5000 х 8 в течение 20 мин, Полученный грубый экстракт наносят на колонку с фосфоцеллюлозой Р размером 1,55 см, уравновешенную 0,02 М трис-НС 1 буфером, рН 7,5, содержащим 1 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,5 мМ ЭДТА и 57 глицерина (бу 1фер А). Несорбированный на колонке материал элюируют 50 мл буфера А. Фермент элюируют 20 мл буфера А, содержащего 1 М ЯаС 1 и диализуют против буфера Б (0,02 М калий фосфатный буфер, рН 7,5, содержащий 1 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,5 мМ ЭДТА и 53 глицерина).После диализа раствор фермента осветляют центрифугированием при 3000 ф в течение 5 мин и супернатант наносят на колонку размером 0,9 х 5 см с бензил-ДЕАЕ-целлюлозой.Несорбированный материал, содержащий фермент, собирают и наносят на колонку размером 0,9 х 2 см с фосфоцеллюлоэой Р, уравновешенной буфером Б.,Фермент элюируют 40 мл линейного градиента ИаС 1 (0,1 М) в буфере Б. Фракции, содержащие растриктазу (элюируемые при 0,4 - 0,45 М 1 ЯаС 1), собирают и диализуют против буфера Б, содержащего 503 глицерина. Выход продукта составляет 2000 ед,/г биомассы. Полученный препарат имеет активность 3000 ед./мл, Активность фермента определяют в реакционной смеси, которая в 20 мкл содержит 1 мкг ДНК фага А, 0,02 М трис - НС 1 буфера, рН 7,5, 0,01 М МРС 1, 0,02 М КС 1, 1 мМ, 2-меркаптоэтанола.оРеакцию проводят при 37 С в течение 1 ч, затем пробы подвергают элект рофорезу в 1 Е-ном агарозном геле, За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фаза А при данных условиях реакции.Отсутствие неспецифических эндонуклеаз и фосфотаз подтверждается б 60высокоэффективным лигированием фрагментов ДНК фага 3, полученных в результате гидролиза полученным препаратом фермента. Правильность лигирования подтверждается повторным гидролизом рестриктазой Ро 1 1 с образованием аналогичных фрагментов. 10 формула изобретения Способ получения эндонуклеазырестрикции Го 1 1 из Г 1 астоЬасСегишоЕеапо 1 оТез, включающ 1 й культивиро вание клеток в жидкой питательнойсреде, содержащей в качестве источника азота белковый гидролизат, в качестве источника витаминов - дрожжевой экстракт, хлористый натрий, глю козу и воду, разрушение клетокультразвуком, хроматографию полученного экстракта на фосфоцеллюлозе иочистку целевого продукта ионообменной хроматографией, о т л и ч а ю - 25 щ и й с я тем, что, с целью повьппения выхода фермента, в качестве продуцента используют Р 1 ачоЪастегпшокеапокоез ВКПМ, в среду длякультивирования дополнительно вводят З 0 хлористый кальций, хлористый калийи сульфат магния, в качестве белкового гидролизата используют пептон приследующем соотношении комопнентов,г/л: 35Пептон ,9,0 -11,0Дрожжевой экстракт 4,0 - 6,0Хлористый натрий 25,0 - 30,0Хлористый калий 0,5 - 1,0Хлористый кальций 2,0 - 3,0Сульфат магния 6,0 - 7,5Глюкоза 0,5 в . 1,5,Вода Остальноеокультивирование ведут при 27-29 С додостижения стационарной фазы роста,а при очистке целевого продукта ионообменную хроматографию проводят набензил-ДЭАЭ-целлюлоза с последующейрехроматографией на фосфоцеллюлозе.